分子诊断技术的其他临床应用（广医三院案例）.pptxVIP

分子诊断技术 的其他临床应用广州医科大学附属第三医院案例案例分析患者张某李某性别女男年龄52岁25岁病史手术前均为经透析治疗且身体状况良好的尿毒症病人供肾来源尸肾母亲术前组织配型HLA配型不符，血型一致HLA配型四点相合，两点错配， 血型一致移植??术后表现2周出现移植区胀痛、少尿，血 液中尿素氮升高、补体水平下 降、血小板减少，经医生给予 适当的免疫抑制剂治疗后缓解术后植入肾功能良好，没有出现 类似张某的情况一年后状况因多次发生上述移植排斥反应 导致肾功能完全丧失而死亡植入肾功能正常，身体状况良好分子诊断技术不仅在感染性、遗传性及肿瘤等疾病的诊断、机制研究以及疗效评估等方面发挥着越来越重要的作用，且在人体器官移 植(包括组织、细胞移植）的组织配型、法医学鉴定领域的个体识 别和亲子鉴定以及在采用血浆游离DNA分子、有核红细胞的单细胞 进行胎儿的单基因遗传病、染色体非整倍体疾病的无创性产前诊断 中，也得到越来越多地应用。第一节 分子诊断技术 在移植配型中的应用广义的器官移植（transplantation）是指应用自体或异体的正常细胞、组织、器官，置换发生病变的或功能缺损的细胞、组织、器官，以维持与重建机 体的生理功能。目前应用较多的是实体器官移植和骨髓、造血干细胞移植等临床同种异体器官移植中常出现排斥反应，但其发生反应的强弱关键取决 于供、受者间组织相容性抗原的差异程度，差异越小，排斥反应越弱，移 植的成功率越高。一、移植配型的基本原理移植配型就是指在器官移植进行之前对供受者抗原的相容性进行检 测，又称组织配型。凡是由供、受者之间的等位基因差异而形成的多态性产物，均有可 能作为组织相容性抗原，诱导机体产生免疫应答以清除“外来”的 移植器官，引起移植排斥反应。能引起移植排斥反应的抗原主要有人类白细胞分化抗原（human leukocyte antigen, HLA）即人类主 要组织相容性抗原（major histocompatibility complex, MHC）次要组织相容性抗原血型抗原组织特异性抗原。HLA位于人第6号染色体短臂p21.31和32区之间，长约4000kb，根据编码分子的功能和分布的不同，可将整个复合体的基因分成三类HLA I类、II类和III类3个区。与移植排斥反应有关的经典HLA基因位于HLA复合体的HLA I类区和HLAII类区内。HLA I类基因包含A、B、C等座位。HLAII类基因包含DR、DP和DQ三个经典HLAII类基因。目前国际上通用的器官移植配型标准是HLA-A、B和DR六抗原无错配标准。最佳的HLA配型为HLA-A、B和DR六抗原分型全相合。I类抗原主要影响受者长期存活率，尤以HLA-B抗原最重要，II类抗原对受者的长期和短期存活率均有重大影响，以HLA-DR抗原最重要。HLA配型与移植效果最为密切的是骨髓移植，因移植物中存在大量的淋巴免疫 细胞可识别宿主抗原，进而攻击宿主靶组织产生移植物抗宿主反应（graft versus host reaction, GVHR），且GVHR不易被免疫抑制剂所控制，故对HLA配型 的要求非常高。二、 移植配型技术HLA分型技术先后经历了血清学、细胞学分型和基因分型阶段。传统的HLA分型技术中以微量淋巴细胞毒实验方法为代表，由于其操作简便 快捷、于1970年被美国国立卫生研究院（NIH）确立为国际通用标准技术。进入90年代，随着分子生物学技术的迅速发展与成熟，建立在DNA分子水平 上的HLA基因分型技术，逐步取代传统分型技术成为HLA的主要分型方法。1999年起美国骨髓捐赠组织（NMDP）以及世界骨髓供者协会（WMDA）都 明确规定必须用DNA方法对骨髓供者进行HLA分型，自此HLA血清分型方法已 完全退出历史舞台被基因分型方法取代。（一）常用的HLA基因分型技术1.PCR-RFLP分型技术原理：依据HLA基因序列在不同部位存在多个不同的酶切位点。实验操作步骤：DNA提取根据HLA基因序列设计特异性引物PCR扩增出包含多态性序列的目的DNA选择可以识别HLA基因多态性序列的限制性内切核酸酶通过内切核酸酶消化切割相应多态性位点的PCR产物经凝胶电泳形成酶切图谱的差异进行检测分型2．PCR-SSO技术（PCR-sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SSO）原理：应用位点或组间特异引物对HLA的多态区域进行PCR扩增，扩 增过程中对产物进行放射性同位素或非放射性标记，根据碱基配对 原则设计系列寡核苷酸探针并将其固定在膜上，PCR产物与膜上探 针进行特异性杂交反应，最后通过放射自显影、显色或化学发光的 信号进行结果判断。如果探针与产物DNA结合则结果阳性，反之， 探针在洗膜中被洗脱，结果阴性。3. PCR-