【培训课件-临床色谱质谱检验技术】_液相色谱质谱技术（五）.pptVIP

接通LC，用FIA优化其他参数 离子源参数优化 MRM定量模式 液相色谱质谱联用方法建立 色谱柱：Proshell 120 EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm） C18 柱分析非极性化合物 窄粒径分布提高了柱效和分离度，粒径选择同时考虑柱压力与色谱系统 柱长短根据分离目的和要求 液相色谱方法建立 流动相 甲醇、水（0.1%甲酸） 洗脱条件 脂溶性物质：在色谱柱上保留强，有机相比例大时（洗脱能力强），才能将它洗脱下来 液相色谱方法建立 液相色谱方法建立 内标的选择 液相色谱方法建立 25-OHD2 25-OHD2的d6标记物 25-OHD2的13C3标记物 25-OHD2的d3标记物 25-OHD3 25-OHD3的13C5标记物 25-OHD3的d6标记物 25-OHD3的d3标记物 25-OHD2测定 IS： 419.4/401.3 定性：413.4/255.2 定量：413.4/395.2 25-OHD3测定 IS： 407.2/389.4 定性：401.4/365.2 定量：401.4/383.3 基质效应 混合实验 通过比较各个不同来源（不同批次）样本的信号响应差异来评价分析方法的精密度。 ①待考察基质中加入合适浓度的待分析物标准品，取6份； ②随机选取6份病人样本（最好按高、中、低浓度水平分布）； ③分别将①和②按1:1比例混合； ④将加标基质、病人样本和混合样本按照分析方法检测（平行处理3份）。 判断标准：混合样本的响应值（待分析物/内标）与病人样本和加标基质响应均值的差异应小于20%。 基质效应 柱后流动注射法 能对整个进样过程基质效应进行评估 改进色谱，使分析物出峰时间避开基质效应的位置 液相色谱质谱联用方法建立 样品处理方法建立 宋斌斌， 秦嘉倩， 彭颖斐，等. 液相色谱－串联质谱法检测血清25－羟基维生素D的方法建立和性能评价 检测目标化合物：25OHD2、25OHD3 样品前处理方法： 样品处理方法建立 血清 取样 加内标（乙腈溶） 振荡、蛋白沉淀 加正己烷 振荡、萃取 离心 分离 取上清液 氮吹干 复溶、离心 上清液转移至进样瓶 LC-MS检测分析 内标液溶剂选择（甲醇） 萃取剂选择（正己烷） 加内标后震荡时间 加正己烷后震荡时间 离心时间 复溶震荡时间 复溶后离心时间 样品处理方法建立 样品处理方法建立 Agilent Bravo 自动移液处理平台 提高效率，节省人力 减少误差，提高结果精密度 * * * * 扫描方式有几种？各有什么样的特点，如MRM是Q1选择性扫描，Q3是选择性扫描。 * 根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。 改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对，先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据要求确定离子对数目 * * 其他的一些代谢产物，组分较多，使用封尾柱改善峰形，特别是对于碱性化合物，改善与硅醇基的保留。 * 流动相中尽量避免使用不挥发性的盐（如硫酸盐、磷酸盐以及含氯的缓冲液等）,以及避免使用表面活性剂和离子对试剂，如十二烷基硫酸钠。常用挥发性添加剂：如甲酸、乙酸、乙酸铵、甲酸铵 * 内标的选择：①稳定同位素标记化合物：最理想的内标；②结构类似物。 要求：（1）检测过程中唯一存在的化合物（如它不应该是一种内源性或外源性化合物） （2）内标不能与测试样本中其他具有共同碎片离子的干扰化合物一起被洗脱出来 （3）内标需与待测分析物具有类似的理化性质、质谱行为和响应特征 （4）将潜在离子增强或抑制而产生的峰分离所造成的影响降到最低。 （5）内标物纯度、浓度，不能发生反应…… * * * SPE柱：具有亲水、亲脂的特性，可转化为96孔微孔板批量处理，每批次同时处理96个。 * * * * * /ChromGall/html/5cec9eb99149b6f9.html * 第五章 液相色谱质谱技术 《临床色谱质谱检验技术》 《临床色谱质谱检验技术》 主要内容 二、小结与思考 一、液相色谱质谱联用技术的临床应用 应用举例Ⅰ：LC-MS/MS应用于维生素D检测 《临床色谱质谱检验技术》 液相色谱质谱联用方法建立 化合物性质 离子化模式——ESI or APCI 化合物 溶解性及极性 分子式 MW 25OHD2 非极性、脂溶性 C28H44O2 412.65 25OHD3 非极性、脂溶性 ?C27H44O2 400.64 ESI与APCI比较 ESI与APCI比较 Max：8.4e5 Max：1.3e5 ESI与APCI比较 寻找母离子 标准溶液进样，Q1 Scan 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP