地中海贫血基因检测-PCR扩增 2(13检本).pptVIP

* 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数 放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 * 这样，在一管里就可以同时检测-α3.7、-α4.2和—SEA三种缺失型，并且设置了内对照，结果直观可靠。 α－珠蛋白基因簇包括二个重复的α基因，一个胚胎期α类基因，三个假基因，一个功能未明的基因，全长约30KB。 在基因组上α-珠蛋白基因周围还存在数个高度同源性类α-珠蛋白基因，它们分别为ζ、ψζ、ψα1、ψα2及θ1，其中ζ-珠蛋白基因在胎儿期表达并合成ζ-珠蛋白链，并与其他类β-珠蛋白链ε-链和γ-链聚合成胚胎型血红蛋白Gowerl〔ζ2ε2〕和胎儿型血红蛋白Portland（ζ2γ2）。这两种血红蛋白在胚胎早期α-珠蛋白基因表达前，对胚胎和胎儿的正常发育具有非常重要的意义。类α-珠蛋白基因与αl-及α2-珠蛋白基因在基因组DNA上串联成簇，称α-珠蛋白基因簇，沿5’、3’方向依次排列为5‘-ζ-ψζ-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-3’，整个基因簇跨越约30KB。 中国人中共发现了7种α地贫缺失基因,有4种α0 基因(- - SEA、- - THAI、- - FIL、- - HW)。 3种α+地贫基因(-α3.7、-α4.2、-α2.7) 。 - - SEA /占了α0 基因的95% ,其它3种α0 基因仅占5% 。 * ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 Gap-PCR（裂口pcr、跨越断裂点PCR） 于缺失序列的两侧设计一对引物，在正常DNA序列中，上下游引物检相距很远，扩增片段很长或超出有效扩增范围而不能生成扩增产物；由于缺失的存在使断端连接而致两引物之间的距离靠近，因而可以扩增出特定长度的片段。 地中海贫血基因检测 PCR扩增DNA 实验目的 1、掌握PCR的原理 2、熟悉PCR操作过程 3、了解PCR的临床应用 实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应，PCR过程类似于DNA的天然复制过程，包括DNA双链解开，引物配对，合成三步； 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 PCR 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR原理:实质就是体外基因复制技术 Mg2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 . 加热变性95 °C 靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C α-地贫实验原理（四重Gap-PCR） 根据α-地贫3种缺失范围及断裂点，分别设计特异引物同时检测，在3种缺失片段的共同区域还设计一对正常内对照引物，当发生任一种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩增;根据阳性扩增片段组合结果诊断各种不同基因型。 　　 α-地贫基因缺失示意图 -a3.7 -a4.2 --SEA ψα2 ψα1 α2 α1 ?1 ζ ψζ 正常内对照 ? -地贫 PCR实验原理 设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。 PCR扩增 （α-地中海贫血） PCR-Mix-I （蓝色管）21μL DNA模板 4μL Total 25μL 96℃ 5 min 98℃ 45sec 65℃ 90sec 72℃ 3 min 98℃ 30sec 65℃ 45sec 72℃ 3 min 72℃ 10 min （25cycles） （10