淀粉磷酸化酶和淀粉分支酶多克隆抗体的制备及蛋白复合体的相互作用研究.pdfVIP

四川农业大学专业硕士论文 摘 要 淀粉作为植物中重要的贮藏多糖，是植物种子的主要成分。淀粉可以为食物提供 80%的能量，是食物的重要组成部分。淀粉是促成各种作物植物产量的主要成分，也 是许多工业应用的可持续原料。淀粉的合成与分解受一系列酶的催化调控，包括淀粉 磷酸化酶 （Starch phosphorylase,SP ）、淀粉合酶 （Starch synthases,SS ）、淀粉分支酶 （Starch Branching Enzymes,SBEI ） 、淀粉去分支酶 （Starch-Debranching Enzymes,DBE ）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 （ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase ） 等。 淀粉磷酸化酶和淀粉分支酶都是植物淀粉生物合成过程中的一个起重要作用的 酶，SP 在植物淀粉贮藏器官中，能够参与支链淀粉侧链修饰反应。SBE 能通过催化 切开多聚糖链的 α-1,4 糖苷键，并在葡萄糖链的特定糖基上形成 α-1,6 糖苷键连接切 短的糖链，从而催化形成淀粉的分支结构，并且另外的非还原末端用于进一步合成淀 粉。前人对淀粉合成及代谢过程中的SBEI 和SPI 的功能开展了大量研究，但其直接 相互作用的蛋白还无定论，在蛋白水平组织分布也未见报道。本研究制备了SBE1 和 SPI 多克隆抗体，弄清了其组织表达分布。用免疫沉淀（IP ）、酵母双杂交方法，研 究了SBE1 和SPI 的相互作用蛋白;在玉米中淀粉合成过程中提出新的多酶复合体组合 方式。 主要获得了以下结果： （1）构建pGEX-6T-1-SPI-C(768-984aa)和pGEX-6T-1-SBEI-C(649-823aa)原核表 达载体。以四川农业大学玉米研究所选育的中国西南地区玉米骨干系 08-641(R08)为 材料，制备cDNA，设计引物，参照NCBI 序列PCR 克隆出完整的SPI （全长2955 bp ） 和SBEI （全长2472 bp ）编码区序列。由于SPI 和SBEI 基因较长，较难在微生物中 表达蛋白；为了制备SPI 和SBEI 的抗原，构建了其带GST 标签C 端结构域原核表 达载体 pGEX-6T-1-SPI-C(768-984aa) ，SPI 基因 C 末端结构域基因片段 651 bp ； pGEX-6T-1-SBEI-C(649-823aa) ，SBEI 基因C 末端基因片段525 bp ，进一步的测序验 证，表明表达载体构建成功。 （2 ）制备和评价SBEI 和SPI 兔源多克隆抗体。以构建成功的原核表达载体转化 BL21(DE3) ，IPTG 诱导其蛋白表达并GST 纯化。以纯化的GST-SBEI-C 和GST-SPI-C 融合蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备SBEI 和SPI 多克隆抗体。以此抗体进 I 四川农业大学专业硕士论文 行Western blot 检测，结果表明制备的SBEI 和SPI 抗体具有较高特异性和灵敏性， 可用于检测纳克级抗原蛋白。用免疫前血清和免疫后血清以及将SPI 和SBEI 作为抗 体对授粉后20 天的玉米胚乳蛋白进行Western blot 检测。结果表明免疫前血清检测不 到SBEI 和SPI 蛋白，免疫后血清可以检测SBEI 和SPI 蛋白，证明抗体成功制备。 SBEI 和SPI 抗体免疫沉淀授粉后的20 天胚乳蛋白，并进行Western blot 检测，结果 显示抗体能够免疫沉淀其蛋白。综上，表明成功制备了SBEI 和SPI 抗体，抗体可用 于Western blot 检测和免疫沉淀(IP)实验。 （3 ）SPI 和 SBEI 在玉米授粉后不同组织的表达。在体外，SPI 和 SBEI 抗体能 识别其抗原，但是否能识别玉米体内其他组织的蛋白还不清楚。为了选取合适的玉米 组织进行抗体体内的验证，首先对 SPI 和 SBEI 进行 qRT-PCR ，分析其在授粉后 15 天的胚乳、籽粒以及根、茎、叶等不同组织中的表达，结果显示在 mRNA 水平上， 在 15 天籽粒和胚乳中表达量较高，根茎叶中表达量较低，且胚乳又高于籽粒，表明 SPI 和