生物化学：第20章 常用分子生物学技术的原理及应用（改）.pptVIP

生化教研室 雷 康 福 常用分子生物学技术的 原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 二 十 章 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 分子杂交技术的原理主要涉及 分子杂交特性（见第二章） 印迹技术 探针技术 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。 一、分子杂交与印迹技术的原理 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR） 一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术 PCR是一种模拟自然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。 根据DNA变性、复性的特点设计。 1993年诺贝尔 化学奖获得者 Kary Mullis 1985年由 穆里斯 首创。 可将微量的目的DNA片断的数量扩增100万倍以上。 PCR扩增目的基因 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 各种PCR仪 PCR体系基本组成成分 含Mg2+的缓冲液 dNTP 耐热DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶 特异性引物 一对分别与待扩增DNA序列5’端相同，3’端互补的寡核苷酸片段。 模板DNA 模板DNA 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP 含Mg2+缓冲液 PCR三步曲 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 循环 25~30 次 使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除 使引物和模板DNA退火结合 此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长 三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环 第一轮循环 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 变性（95℃） 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 退火（60℃） 延伸（72℃） DNA-Pol DNA-Pol 温度 第二轮循环 5/ 5/ 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 5/ 5/ 5/ 5/ 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 第三次循环 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 5/ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 基因组DNA DNA样品 第一次循环 第二次循环 第三次循环 第四次循环 待扩增序列 引物A 引物B 3/ 5/ 3/ 5/ 5/ 3/ 5/ 3/ PCR 二、PCR的主要用途 PCR的 用途 基因突变 分析 基因的 体外突变 目的基因 的克隆 DNA 序列测定 DNA和RNA 的微量分析 1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因； 2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段； 3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。 RNA需要反转录。 利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）逆转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第三节 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存