生物化学资料：李昌龙 基因重组和基因工程改.pptVIP

* * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * * (插入失活法) 抗药性标记选择 α-互补现象（标志补救）： 因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏阅读框架，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）。 当这种载体转入可编码β －半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-B-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷 原位杂交 菌落原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 标准： 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 第三节 重组DNA技术与医学 的关系非常密切并前景远大 DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 一、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 疾病基因发现的两个典型例子: 脆性X综合征 Kallmann综合征 二、生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 克隆羊多利 2008年2月14日，苏格兰罗斯林研究所发表新闻公报：由于多利患有进行性肺病， 世界上首只克隆羊多利被执行“安乐死” 英下院通过人兽混合胎议案 人猿战士或成现实 2008.05.19 人兽混合胚胎培育图 电影中的“人猿战士” 　 韩国顺天大学的科学家们使用母猫的皮肤细胞，对其进行基因改造，通过使用病毒使这个细胞具有荧光蛋白基因，然后将其植入移除掉细胞核的卵细胞中，卵细胞随后又被植入代孕猫的子宫，皮肤暴露在紫外光下，就能发出红色光。 荧光猫 2007.12 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞