免疫学实验课件：实验二细菌抹片制备及染色、培养基的制作、.pptVIP

实验二 细菌的抹片制备及染色 一 概述 细菌细胞微小，无色而透明，直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色后，则能较清楚地显示其形态和结构，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。 二 、目的要求 1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏染色 2.认识革兰氏染色的反应特性 三 实验材料 1.载玻片 接种环 酒精灯 火柴 生理盐水 各种染液等 2.菌种：大肠杆菌 葡萄球菌 固定： 做好的涂片染色前必须先固定。目的是杀死细菌，同时增加细菌对染料的亲和力。固定方法有两种： 1、火焰固定：将干燥好的抹片，使其抹面向上，以其背面 在酒精灯外焰上略做加热。 2、化学固定：将以干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟，自然挥发干燥。 做好的抹片就可以进行各种染色方法了。 2.染色方法 几种常用的染色方法：美蓝染色法，瑞士染色法染色法，抗酸染色法，革兰氏染色法。重点介绍革兰氏染色法。 革兰氏染色法： （1）.在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1-2分钟水洗。 （2）.加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水洗。 （3）.加95%酒精于抹片上脱色，约20秒，水洗 （4）.加稀释的石碳酸复红复染1分钟，水洗。 （5）.吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 革兰氏染色法的原理： 革兰氏阳性菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经95%酒精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。 革兰氏阴性菌的细胞壁。其脂类含量较多，当以95%酒精脱色时，脂类被溶去，使得细胞壁空隙变大，尽管95%酒精处理能使肽聚糖空隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，细胞壁缩小有限，故让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被95%酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。 瑞士染色： 瑞士染色:是组织快速染色，检测有没有细菌的存在。 步骤：滴瑞氏染液至载玻片上，3-5min用水冲洗。 抗酸染色法： 细菌抹片的制备：涂片卡介苗（结核杆菌）涂抹在玻片上然后干燥，火燃固定。 （1）.滴加复红几滴在酒精灯上加热3-5min至冒蒸气，冷却后用水冲洗。 （2）.用酒精脱色30s-1min （3）.美兰复染1min 结果：抗酸性呈红色，非抗酸性呈蓝色 镜检 将革兰氏染色的进行显微镜油镜检并画图  一、 目的要求 1.掌握一般培养基制备的原则和要求 2.熟悉一般培养基制备的过程 3掌握培养基酸碱度的测定 二、 培养基的概念和类型 培养基(medium)是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异，所以培养基一般用于细菌的分类、鉴定、菌种的保藏。 根据原料来源不同，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基与天然培养基。 根据物理性状可分为三大类：液体培养基、半固体培养基、固体培养基 。 三 、制作的一般要求 1.培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。 2.培养基的材料和盛培养基的容器没有抑制细菌生长的物质。 3.培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求。多数细菌生长适宜pH范围是弱碱性(pH7.2-7.6)。 4.所配制的培养基应该是透明的，而且要彻底灭菌。 四 、实验材料 1 器皿：量筒、 试管 、 pH试纸 、天平、 电炉或电磁炉、 试管塞、漏斗、滤纸、试管架、药匙、瓷缸、称量纸、橡皮筋、报纸等。 2试剂：牛肉膏 、蛋白胨 、氯化钠、 琼脂粉、 蒸馏水、0.1mol/L 的氢氧化钠溶液、 0.1mol/L的盐酸溶液等。 五 、方法和步骤 培养基的配方 1.普通肉汤培养基，琼脂培养基的制备 100ml肉汤 牛肉膏粉 0.5克 蛋白胨 1克 氯化钠 0.5克 普通琼脂：1.取50ml肉汤分装试管10支／4-5ml 2.取50ml肉汤+1.5~1.8克（琼脂粉2-3%） 用电磁炉加热熔化琼脂（需要完全融化） 10支／4-5ml 制备方法与步骤： 1.准确称量 2.混合加热溶解调pH值至7.6 3.加热煮沸维持5分钟（注意补充体积） 4.过滤 5.分装：4-5mL/管 5.灭菌15p 15-20min (103.41kpa 15磅压力） 6.营养琼脂趁热摆斜面，完全凝固后，放置37℃培养箱进行无菌检查，18