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1. 转录因子 RUNX1与 KLF4相互作用及转录调控对 t （8；21）白 血病细胞生物学功能的影响 2. 新型 LSD1抑制剂 JL1037 的抗白 血病作用及其机制研究 研究目的 : 实验室前期用组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠 (PB) 诱导 t(8;21) 白血病细胞系 Kasumi-1 分化、凋亡时发现 ,RUNX1、KLF4和 P57的表达 水平明显升高 , 且通过生物信息学分析发现三者之间可能存在转录调控关系及蛋 白质相互作用。本研究旨在分析 RUNX1、 KLF4和 P57 之间的相互作用关系 , 并通 过体外、体内实验探讨 RUNX1、KLF4和 P57在 t(8;21) 白血病细胞中的生物学功 能。 研究方法 : 实时定量 PCR技术和 Western Blot 技术检测 PB处理 Kasumi-1 细胞后 RUNX1、KLF4和 P57 的 mRNA和蛋白表达变化。构建包含 RUNX1结合位点 KLF4启动子 / 增强子报告质粒和包含 KLF4结合位点的 P57启动子 / 增强子报告质粒 , 双荧光素酶报告基因系统分析 RUNX1、 RUNX1-ETO对 KLF4的转录调控作用以及 KLF4对 P57的转录调控作用 , 并应用 WesternBlot 技术在蛋白水平进行验证。 免疫荧光共聚焦和免疫共沉淀技术检测转录因子 RUNX1、RUNX1-ETO与 KLF4 的共定位以及蛋白质相互作用 , 明确具体的结合结构域 , 并进一步探讨 PB能否抑 制 RUNX1、 RUNX1-ETO与 KLF4的结合。双荧光素酶报告基因系统分析 RUNX1、 RUNX1-ETO与 KLF4结合对 KLF4转录调控功能的影响。 构建 RUNX1、KLF4和 P57 的慢病毒表达载体 , 包装病毒 , 感染 Kasumi-1 细胞 , 研究上述基因过表达对 t(8;21) 白血病细胞增殖、周期、凋亡和分化等生物学功 能的影响。构建 KLF4和 P57 逆转录病毒表达载体 , 包装病毒 , 感染 t(8;21) 白血 病小鼠的骨髓白血病细胞 , 流式细胞仪分选阳性细胞 , 移植受体小鼠 , 研究 KLF4 和 P57 过表达对 t(8;21) 白血病小鼠发病率和生存期的影响。 研究结果 :PB 处理 Kasumi-1 细胞后 ,RUNX1、KLF4和 P57 的 mRNA和蛋白表达 水平均明显升高。RUNX1以剂量依赖性的方式激活 KLF4启动子 / 增强子报告质粒 , 而 RUNX1-ETO对 KLF4启动子 / 增强子报告质粒的转录激活作用明显减弱。 KLF4对 P57启动子 / 增强子报告质粒亦存在剂量依赖性的激活作用。 在细胞 系中过表达 RUNX1可以上调 KLF4和 P57的蛋白表达 ; 而过表达 RUNX1-ETO对 KLF4 和 P57 的蛋白表达无明显影响 ; 过表达 KLF4,P57 的蛋白表达升高。 RUNX1、 RUNX1-ETO与 KLF4均存在蛋白质相互作用 , 且共定位于细胞核内。 RUNX1通过 RUNT同源结构域 (Runt homology domain,RHD) 与 KLF4 结 ,RUNX1-ETO除 了通过 RHD 还通过 ETO部分与 KLF4结合。 RUNX1-ETO竞争性地抑制野生型 RUNX1与 KLF4的结合 , 组蛋白去乙酰化酶抑 制剂 PB不影响 RUNX1、RUNX1-ETO与 KLF4的结合。RUNX1与 KLF4结合促进 KLF4 对下游靶基因的转录激活 , 而 RUNX1-ETO与 KLF4结合对下游靶基因转录并无明显 的促进作用。 t(8;21) 白血病细胞中过表达 RUNX1、KLF4和 P57 均能抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡 , 此外 ,KLF4 还具有诱导白血病细胞分化的生物学功能。体内实验结果表明 ,KLF4 和 P57过表达可以降低 t(8;21) 白血病小鼠的发病率。 研究结论 : 本研究发现了 (8;21) 白血病细胞系中 RUNX1→ KLF4-P57 新的调控信号通路 ,RUNX1通过转录激活 KLF4进而激活 P57抑制 t(8;21) 白血病细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。而当 RUNX1发生染色体易位形成 RUNX1-ETO 融合蛋白时 , 上述作用消失。 此外 ,RUNX1还通过与 KLF4发生蛋白质相互作用 , 进一步增强 KLF4对下游靶 基因的转录激活 , 上述作用可以被 RUNX1-ETO竞争性地抑制。本研究阐明了转录 因子 RUNX1与 KLF4之间的作用关系以及 RUNX1-ETO融合蛋白对这种作用关系的 影响。 研究目的 : 组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶 1(LSD1)在白血病中高水