膜片钳关键技术原理与基本操作.docVIP

膜片钳技术原理和基础操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一个以统计经过离子通道离子电流来反应细胞膜上单一或多数离子通道分子活动技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳试验方法和电子线路进行了改善，形成了当今广泛应用膜片钳试验技术。该技术可应用于很多细胞系研究，也是现在唯一可统计一个蛋白分子电活动方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大前进动力，这一伟大贡献，使Neher 和Sakmann 取得1991 年诺贝尔医学和生理学奖。 膜片钳技术基础原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 玻璃微电极接触细胞膜表面，经过负压吸引使电极尖端和细胞膜之间形成千兆欧姆以上阻抗封接，此时电极尖端下细胞膜小区域（膜片，patch）和其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上离子通道离子电流进行监测及统计。 基础仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震试验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞统计关键设备，含有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是经过单根电极对细胞或膜片进行钳制同时统计离子流经通道所产生电流。膜片钳放大器关键部分是以运算放大器和反馈电阻组成电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管选择：有二种玻璃类型，一是软质苏打玻璃，另一是硬质硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极串联电阻，对膜片钳全细胞统计模式很有利；硬质玻璃噪声低，在单通道统计时多选择。玻璃毛细管直径应符合电极支架规格，通常外部直径在1.1~1.2mm。内径1mm。(2) 电极拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径通常在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调整第一步和第二步拉制时加热线圈电流强度，即可得到所需要电极尖端直径。电极必需保持洁净，应现用现拉制。(3) 涂硅酮树酯：统计单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它含有疏水性、和玻璃交融亲密、非导电性特征。涂完硅酮树酯玻璃微电极须经过加热镍铬电阻线圈烘干变固，以防硅酮树酯顺着电极流向尖端而影响千兆封接。烘干后才能进行热磨光。(4) 热磨光(heat polish)：通常在玻璃研磨器下对电极尖端进行热磨光，磨光后可使电极尖平滑并烧去过多硅酮树酯薄膜，有利于千兆封接形成。现在大多数试验室在作全细胞模式统计时，不涂硅酮树酯也不进行热磨光，也可形成很好千兆封接。(5) 电极液充灌：现在最常应用是用注射器反向充灌。用细长注射器针头或拉细聚乙烯胶管从电极尾端插入到电极尖端，再进行灌注。灌注后电极尖端有少许气泡，排除气泡方法是用左手拿住电极，尖端向下，用右手轻轻弹击电极，可见气泡渐渐上升直至排除。电极液不要充灌太满，能和探头银丝接触上即可，溶液过多会浸入探头支持架致使潮湿而影响试验统计。 2.溶液组成(1) 电极液：依据统计电流不一样电极液成份也不一样。基础要求是等张KCI 溶液，Ca2+ 浓度为10~100nmol (pCa 7~8)，pH 值7~7.4。这里介绍一个在全细胞统计模式时，经过改变保持电位，能分别统计到Na+、K+、Ca2+ 电流电极液成份(mmol/L)：K Aspartic 49.89，KCI 30.37， KH2PO4 25，HEPES 20.12，EGTA 0.999，KOH 29.95，MgCl2 1，CaCl2 0.2，ATPNa2 6.8。用KOH 调pH 至7.4。假如要统计纯Na+、K+、Ca2+ 电流，则需要使用对应工具药。HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙烷磺酸）(2) 细胞外液（浴槽液）：分离细胞和统计电流时应用。分离神经细胞关键用人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid solution，ACSF），成份（mmol/L）：NaCl 124，KCl 2.5，NaH2PO4 1.25，MgSO4 2.0，CaCl2 2，NaHCO3 26，glucose 10。该液体需要通以95%O2＋5%CO2 混合气体。假如用HEPES 作缓冲系，则ACSF 成份以下（mmo