低纤维素酶背景里氏木霉表达宿主菌的构建.pdfVIP

摘 要 丝状真菌里氏木霉 （Trichodermareesei）是重要的纤维素酶工业生产菌株。由于它卓越的产 酶性能，近年来越来越多的研究将其作为异源基因的表达宿主。里氏木霉产生的内源纤维素酶数 量较多，它们主要包括纤维二糖水解酶 （外切葡聚糖酶）和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达 外源基因时，它们会形成较高的纤维素酶背景，而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分 泌等相关资源的占用。本实验应用CRISPR/Cas9技术并结合RNAi 干扰技术，敲除和干扰里氏木 霉中的主要的纤维素酶基因，构建里氏木霉低纤维素酶表达菌株。实验还发现，以低纤维素酶背 景菌株作为表达宿主，可以明显提高部分异源基因的表达水平。本研究进行了如下工作： 1. 应用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉中主要的纤维二糖水解酶cbh1基因，同时结合RNAi 干扰技术沉默内切葡聚糖酶eg2基因在里氏木霉中的表达 应用CRISPR/Cas9技术，在体外组装Cas9/gRNA 复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的 纤维二糖水解酶cbh1基因，同时结合RNAi 干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因，以期 一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。使用这种方法获得了一株纤维素酶表达显著下降 的11号转化子SUS6。该转化子中，cbh1 的表达完全消失，而eg2 基因的转录水平较出发菌株 SUS5 降低了98%。 2. 在SUS6菌株中表达外源基因NfBgl3A 以SUS6为宿主表达外源基因NfBgl3A，两个代表性转化子的beta-葡萄糖苷酶酶活最高分别 为172. 和79.3U/mL，远高于以出发菌株 （高纤维素酶背景）为宿主表达beta-葡萄糖苷酶酶活 （两个代表转化子分别为11.6和31.9U/mL）。然而，表达黑曲霉来源的甘露聚糖酶时酶活并没 有明显的提高。因此，构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主，还可选择性的显著提高某些异 源基因的表达水平。 3. 在SUS6菌株的基础上应用CRISPR/Cas9技术敲除主要分泌蛋白木糖苷酶xyl3A 和纤维素酶 cbh2、eg1基因 本实验在SUS6 菌株的基础上，首先通过5-FOA 反向选择，将木霉菌种的pyr4 筛选标记去 除，而后通过胞内表达Cas9 核酸酶并结合gRNA 的表达，敲除xyl3A 基因，在48 个转化子中筛 选到一株xyl3A 基因被敲除的菌株SUS7。再以SUS7 菌株作为宿主菌，敲除pyr4 筛选标记，后 应用CRISPR/Cas9技术，在体外组装Cas9/gRNA 复合物并结合同源重组臂，共同转化里氏木霉 以分别定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh2基因以及内切葡聚糖酶eg1 基因，进一步构建里氏 木霉低纤维素酶背景的表达体系。 4. 里氏木霉中基于CRISPR/Cas9 的新型编辑方法的探索 CRISPR/Cas9 系统作为第三代基因组编辑技术，具有高效的基因编辑能力，但是当我们在里 氏木霉中应用时，发现其效率仍然很低。针对这一问题，我们对CRISPR/Cas9 系统从各个角度尝 试进行改进，如对驱动gRNA 的启动子的改造、对Cas9 蛋白进行突变、加入非同源DNA、加入 小分子物质、使用热胁迫条件等，以期提高CRISPR/Cas9 系统在里氏木霉中的基因编辑效率。 综上所述，本研究综合应用各种方法，构建了里氏木霉低纤维素酶背景的表达菌株；以构建 I 过程中的菌株作为表达宿主，能明显提高某些异源基因的表达水平。此外我们还对一些新型的编 辑方法进行了有益的探索。 关键词：里氏木霉，CRISPR/Cas9，RNAi，纤维素酶 II Abstract The filamentous fungus Trichoderma reesei is an important cellulase industrial production strain. Due to its excellent enzyme-producing properties, more and more studies have been carried out in recent years to use it as an exp