广谱降解饲料中主要霉菌毒素的酶作用机制及高效表达.pdfVIP

摘 要 霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，对人和动物的健康具有严重威胁。在众多脱毒方法中，酶 法脱毒因绿色环保而备受关注。但目前报道的霉菌毒素降解酶无法满足对多种霉菌毒素的混合污 染进行有效处理的要求。基于此，本研究首先对锰过氧化物酶 （Manganese peroxidase ，MnP ）进 行了生化表征，发现锰过氧化物酶可降解饲料中的多种霉菌毒素。而后，对漆酶的广谱霉菌毒素 降解能力进行了实验研究并初步探讨了降解机制。最后，利用毕赤酵母（Pichia pastoris ）和里氏 木霉（Trichoderma reesei）外源蛋白表达系统分别对Moniliophthora roreri 来源的锰过氧化物酶和 Melanocarp us albomyces 来源的漆酶进行了高效表达和上罐发酵。以期通过研究，对锰过氧化物 酶及漆酶-介体体系广谱降解霉菌毒素的能力具备一定认识，为广谱霉菌毒素降解酶的实际应用奠 定基础。具体如下： 对重组表达的7 种分别来源于Irpex lacteus CD2、Phanerochaete chrysosporium 、Ceriporiopsis subvermispora 和商业化Nematoloma frowardi i 来源的锰过氧化物酶降解霉菌毒素的能力进行了分 析。结果表明，上述锰过氧化物酶均能降解饲料中的4 种主要的霉菌毒素 （黄曲霉毒素B 、玉米 1 赤霉烯酮、呕吐毒素及伏马菌素 B ）。其对黄曲霉毒素 B 的降解率介于78.4%-100.0%，对玉米 1 1 赤霉烯酮的降解率介于42.2%-94.3%，对呕吐毒素的降解率介于42.9%-96.3%，对伏马菌素B1 的 降解率介于22.2%-43.6% 。 研究了Bacillus subtilis 来源的漆酶BsCotA 对黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮的降解。在无介 体体系中，BsCotA 用量为0.03 U/mL 时，黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮的降解率仅为 18.2%和 17.6% 。选择 9 种结构确定的小分子物质作为漆酶介体参与霉菌毒素降解。结果表明，丁香酸甲 酯是漆酶BsCotA 降解霉菌毒素的最佳介体。BsCotA-丁香酸甲酯体系对黄曲霉毒素B1 和玉米赤 霉烯酮的降解率分别为98.0%和100.0%。而且，多种植物提取物（淫羊藿、荆芥等）也可作为漆 酶BsCotA 的有效介体。同时，商业化Ganoderma sp.来源漆酶也能够利用上述介体降解霉菌毒素。 利用不同的有机酸体系及自由基捕获剂对 I. lacteus CD2 来源的锰过氧化物酶 IlMnP5 和 IlMnP6 降解黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮的反应机制进行初步研究。结果表明，自由基在锰过 氧化物酶降解霉菌毒素过程中发挥着重要作用。同时，锰过氧化物酶还可通过直接与玉米赤霉烯 酮反应使其降解。在此基础上建立了利用染料RB5 对高霉菌毒素降解能力的锰过氧化物酶进行高 通量筛选的方法。利用UHPLC-MS/MS 鉴定出了锰过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯 酮的可能产物。利用UHPLC-MS/MS 对漆酶BsCotA-丁香酸甲酯体系降解黄曲霉毒素B1 和玉米 赤霉烯酮的产物进行分析。结果表明，体系中的反应包括漆酶对霉菌毒素、丁香酸甲酯的氧化及 苯氧自由基与其他分子发生耦联。最后，利用水螅、酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae BLYES 及结肠癌细胞Caco-2 为模型，对黄曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮经锰过氧化物酶和漆酶-介体体系 降解后产物的毒性进行检测。结果表明，经两类酶降解后的毒素毒性均显著降低。 利用饲料酶制剂工业生产中常用的毕赤酵母表达系统和里氏木霉表达系统对 M. roreri 来源 的锰过氧化物酶和M. albomyces 来源的漆酶进行了异源表达研究，并进行了上罐发酵。结果表明， 毕赤酵母X33 菌株可成功表达M. roreri 来源锰过氧化物酶，上罐发酵至108 h 时，锰过氧化物酶 最高酶活2074.1 U/L 。利用里氏木霉成功表达了M. albomyces 来源的漆酶，上罐发酵