固氮施氏假单胞菌硝酸盐同化调控基因nasST_nasR的转录特性研究.pdfVIP

摘 要 硝酸盐同化作用是氮循环一个重要环节，其中硝酸盐还原成亚硝酸盐是同化作用的第一个氧 化还原反应，微生物在这个过程中发挥了关键作用。目前已报道有两套典型的硝酸盐同化途径， 分别是棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii ）中由双组份NasST 调控的硝酸盐同化系统和产酸克氏 杆菌 （Klebsiella oxytoca ）中由NasR 调控的硝酸盐同化系统，两套系统的信号响应及调控机制 差异明显。施氏假单胞菌A1501 （Pseudomomas stutzeri A1501 ）是一株根际联合固氮菌模式菌株。 该菌不仅能在微好氧条件下固氮，也可在厌氧条件下以硝酸盐为电子受体进行反硝化固氮，同时 还具有较强的硝酸盐同化能力。基因组分析表明A1501 同时含有NasST 和NasR 两类调控蛋白， 但两套调控蛋白的功能及其调控机制尚不清楚。本研究采用5’RACE 、RT-qPCR 和启动子融合表 达分析等方法，研究了nasST 和nasR 基因的编码区特征及启动子转录特性，主要结果如下： 1. 分别测定了不同温度和pH 梯度条件下，A1501 以硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源的生长曲 线，结果表明A1501 在37℃、pH8.0 条件下长势最佳。此外，测定了A1501 在不同浓度梯度亚 硝酸盐为唯一氮源条件下的生长曲线，结果表明A1501 在6 mM 以上的亚硝酸盐中生长变弱，推 测高浓度的亚硝酸盐对细胞有毒性；比较了A1501 野生型及氮调控关键基因ntrC 和nifA 突变株 的硝酸盐同化能力，结果发现，nifA 突变株的生长比野生型略有增强，但ntrC 突变株完全丧失了 硝酸盐和亚硝酸盐的利用能力，RT-qPCR 分析表明，ntrC 突变株中硝酸盐、亚硝酸盐转运蛋白编 码基因nasA 与nasF 、硝酸盐还原酶编码基因nasB 均下调95% 以上；此外，调控基因nasR 下调 了70%，双组份调控系统基因nasS 下调40%，表明A1501 菌的硝酸盐同化途径受NtrC 蛋白的调 控。 2. 利用5’RACE 方法分别确定了nasST 和nasR 的转录起始位点，在此基础上构建了不同长 度DNA 片段的启动子-lacZ 融合表达载体，通过比较不同载体的β-半乳糖苷酶活性确定了nasST 和nasR 的启动子区间，即nasST 的启动子区间为-272 至+1 区，nasR 的启动子区间为-315 至+1 区；分析了nasST 和nasR 启动子的序列特征，结果表明nasST 和nasR 基因的启动子均存在3 个 可能的NtrC 保守结合位点以及一个可能的RNA 聚合酶σ 因子RpoN 保守结合位点。 3. 分别测定了不同氮源条件下nasST 和nasR 基因启动子-lacZ 融合表达载体的β-半乳糖苷酶 活性，结果表明，nasST 基因的表达不受氮源影响，而nasR 基因仅在硝酸盐和亚硝酸盐条件下诱 导表达，在铵离子条件下低水平表达；进一步测定了NtrC 和RpoN 结合位点缺失（突变）对nasST 和nasR 启动子活性的影响，结果表明nasST 启动子上-39 至-19 区的NtrC 结合位点可能是转录激 活所必须，而nasR 启动子在-291 至-275 区的NtrC 结合位点是转录激活所必须；RpoN 保守结合 位点的突变不影响nasST 启动子活性，但导致nasR 启动子丧失转录活性。 综上所述，A1501 存在两套不同的硝酸盐调控系统NasST 和NasR ，nasST 基因的表达不 受氮源影响，其启动子是非 σ54 依赖型；nasR 的表达受硝酸盐和亚硝酸盐诱导，受铵抑制，其 启动子为NtrC 和RpoN 依赖型。本研究为阐明A1501 硝酸盐同化系统的网络调控机制奠定理论 基础。 关键词：施氏假单胞菌A1501 ，硝酸盐/亚硝酸盐同化，转录特性，nasST ，nasR I Abstract Nitrate assimilation is an important part of nitrogen cycle. The reduction of nitrate to nitrous acid is the first redox reaction of assimil