柑橘黄龙病病菌亚洲种Sec依赖分泌蛋白的预测、鉴定及功能研究.pdfVIP

摘 要 柑橘黄龙病( Citrus huanglongbing, HLB)是影响柑橘生产的一种毁灭性病害，在全球主要柑橘 产区造成严重危害。该病害由柑橘木虱传播，目前已鉴定出韧皮部杆菌的三个暂定种可引发柑橘 黄龙病，分别是柑橘黄龙病菌亚洲种( Candidatus Liberibacter asiaticus) ，非洲种( Ca. L. africanus) 和美洲种( Ca. L. americanus) 。柑橘黄龙病病菌尚未能完成离体培养，其致病机理仍不明确。宏基 因组测序结果表明，柑橘黄龙病菌亚洲种基因组大小仅为1.23 Mb ，缺失了许多独立生存所必需 的基因和常规的效应蛋白所依赖的分泌系统。但黄龙病菌拥有完整的Sec 依赖蛋白分泌系统，该 分泌系统可以分泌许多重要的持家蛋白，且对维持细菌活力至关重要。近年来，一些Sec 依赖分 泌蛋白被鉴定出是黄龙病菌侵染过程中重要的的毒力因子。本研究对黄龙病菌亚洲种Psy62 菌株 Sec 依赖分泌蛋白进行了全基因组预测，并对其功能进行了分析。 (1) Sec 依赖分泌蛋白的全基因组预测 对柑橘黄龙病菌亚洲种Psy62 基因组编码全部蛋白进行分析，共得到57 个可能的 Sec 依赖 分泌蛋白。进一步预测了这 57 个蛋白是否含有跨膜结构、信号肽序列、剪切位置和方式，以及 潜在的蛋白功能。为了对分泌蛋白的信号肽功能进行实验验证，构建了一套更高效的PhoA 检测 系统。利用病毒载体将57 个分泌蛋白在本氏烟上进行接种试验，共鉴定出其中CLIBASIA_02470, CLIBASIA_03875, CLIBASIA_04405 3 个分泌蛋白具有抑制BAX 和INF1 诱发的坏死的功能。 (2) 分泌蛋白m3875 的鉴定及功能分析 CLIBASIA_03875 含有 51 个氨基酸，通过蛋白序列检索分析发现该蛋白为柑橘黄龙病菌亚 洲种特有，PhoA 系统验证其 N 端 29 个氨基酸为信号肽序列，可以介导蛋白的胞外分泌。 CLIBASIA_03875 完成剪切后，成熟蛋白m3875 共含有22 个氨基酸，亚细胞定位分析显示m3875 在本氏烟表皮细胞中无特异定位。m3875 可以抑制INF1 和BAX 在本氏烟叶片诱发的坏死反应， 同时可以使PVX 病毒在本氏烟上产生更持久严重的症状。m3875 的极性氨基酸位点( D7, R9, R11 和 K22)进行丙氨酸替换突变后均未对其功能产生影响。实验结果显示，m3875 可能通过直接或 者间接互作的方式，影响寄主NbCNGC23-26 ，NbBI-2 和NbWRKY9 的功能或者表达量，进而干 扰寄主的防卫反应。 (3) 分泌蛋白m4405 的鉴定及功能分析 CLIBASIA_04405 仅在柑橘黄龙病亚洲种中存在，利用PhoA 系统验证其信号肽序列具有介 导蛋白胞外分泌的功能。m4405 可以抑制INF1 和BAX 在本氏烟叶片诱发的坏死反应。突变体分 析表明，两个极性氨基酸簇( A45-47 和A64-65)突变导致其抑制BAX 诱导的坏死发生功能受到较 大影响，而7 个极性氨基酸簇（A24-25 、A39-40 、A45-47 、A52-A54 、A64-65、A75-78 和A93-94 ） 被突变后都影响了m4405 抑制INF1 诱发坏死的功能。转m4405 本氏烟表现出了矮小畸形等表型， 同时对丁香假单孢菌番茄变种Pst DC3000 ( hopQ1-1)表现出了更高的耐病性。进一步分析表明， 过量表达m4405 会影响光合作用途径相关基因、小热激蛋白基因以及维生素B6 合成途径相关基 因的表达量，且m4405 与本氏烟过氧化氢酶存在直接互作。 综上，本研究预测出柑橘黄龙病菌亚洲种Psy62 基因组共有57 个 Sec 依赖分泌蛋白，从中 鉴定出3 个Sec 分泌蛋白具有抑制细胞程序性死亡功能，并对其中两个蛋白进行了深入的功能分 I 析。m3875 和m4405 虽然同样具有抑制寄主PCD 功能，并且能影响寄主正常生长，但依赖不同 的分子机制。以上研究结果为后续的黄龙病菌致病机制的研究奠定了一定基础。 关键词：柑橘黄龙病菌，Sec 分泌蛋白，致病机制，抑制坏死 II