基于植物酯酶与荧光分析的农药残留快速检测方法研究.pdfVIP

摘 要 有机磷及氨基甲酸酯类农药在农产品生产中广泛使用，是防治病虫害、保障农产品数量安全 的重要抓手，但部分农药因毒性大被禁止或限制使用。多年来，因生产者超量、超范围等违规使 用有机磷及氨基甲酸酯类农药导致的农产品质量安全事件占比最高，快速检测是第一时间发现问 题、实现有效监管的重要科技支撑。酶抑制法因成本低、方便、速度快，成为近二十年来应用最 多的有机磷及氨基甲酸酯类农药的标准快速检测方法，但因该方法所用关键酶及复杂基质的限制 易导致检测结果出现高比例假阳性、假阴性，在实际工作中无法用于应急监管和日常保障，因此， 对传统酶抑制法进行创新是当务之急，也是当前国家重大需求。 基于上述背景，本论文以高活性植物酯酶为研究目标，通过植物种子筛选并分离纯化出红芸 豆酯酶，进一步对其酶学性质进行深入研究。在此基础上，以荧光分析手段代替传统的可见分光 光度法，建立了基于红芸豆酯酶和荧光分析的有机磷及氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法。主 要研究内容及结果如下： 1. 通过比较多种植物来源的植物酯酶粗酶酶活、比酶活、农药敏感性等，确定最佳植物来源 为红芸豆，并利用离子交换色谱技术对红芸豆酯酶进行了分离纯化，SDS电泳表明目标酯 酶纯化效果良好，其分子量为100 kD 。 2. 对红芸豆酯酶的酶学性质进行了表征，研究发现红芸豆酯酶的最适pH 为7.5，在pH 6.0~8.0 之间酶活保持稳定；最适温度为35℃，在温度为25℃~35℃之间酶活保持稳定；对不同有机溶剂 的耐受性存在较大差异，该酶对乙腈耐受性较差，对乙醇、甲醇耐受性相似，其中低浓度的甲醇 对酶活性表现出促进作用；不同金属离子对红芸豆酯酶的影响不同，其中Cu2+对该酶具有显著抑 制作用，这种抑制作用可由金属离子螯合剂EDTA 在一定程度上解除。 3. 通过研究红芸豆酯酶对几种常见的荧光底物 MUA 、MUB 、FDA 及吲哚乙酸酯的水解情 况、底物自身稳定性及动力学参数，最终确定吲哚乙酸酯为最佳底物，建立了以红芸豆酯酶为酶 源、以吲哚乙酸酯为底物的农药残留快速检测方法，并优化了反应体系，在最佳检测条件下，对 敌敌畏，敌百虫、丙溴磷等多种有机磷农药的选择性进行了分析，结果表明：本研究建立的检测 方法对敌敌畏、敌百虫等8 种有机磷及氨基甲酸酯类农药具有良好的选择性，其IC50 值均低于相 关国标，并以大白菜为基质对该方法进行了应用研究，结果表明该方法具有一定的抗基质干扰能 力，能够满足实际检测的需求。 4. 利用植物酯酶、乙酰胆碱酯酶与微生物酯酶均对有机磷及氨基甲酸酯类农药具有良好选择 性，构建了一种三元OR 逻辑门，以农药对不同酶的抑制率是否大于50%为输入信号，得到不同 输出信号，实现对样品中农药残留的检测，将农药检测范围由原来的6~8 种扩大至 16 种，提高 了结果的可靠性。同时，利用乙酰胆碱酯酶与过氧化物模拟酶PtNPs 构建了一种二元INHIBIT 功 能酶逻辑门，通过过氧化物模拟酶 PtNPs 的二次催化实现信号放大，提高了检测方法的灵敏度， 对敌敌畏和呋喃丹的检出限低至2.3 μg/L 与1.4 μg/L 。 关键词：植物酯酶，酶抑制法，有机磷农药，氨基甲酸酯类农药 I Abstract Organophosphorus and carbamate pesticides are widely used in the production of agricultural products, which are important grasps for controlling pests and diseases and ensuring the safety of agricultural products. However, some pesticides have been banned or restricted due to their high toxicity. Over the years, the agricultural products quality and safety incidents caused by the illegal and excessive us