TRIM35蛋白抗流感病毒分子机制研究.pdfVIP

摘 要 A 型流感病毒是一种有囊膜、基因组分节段的单股负链RNA 病毒。它在全球范围内的广泛 流行导致了重大公共卫生安全问题，对人类的生存和发展构成重大威胁。与所有其他病毒一样， 流感病毒在复制过程中与大量宿主蛋白存在直接或间接的相互作用。识别在病毒复制过程中发挥 促进或抑制作用的宿主分子可以为抗流感病毒药物研发提供有价值的新靶点。TRIM 家族蛋白具 有多种不同的功能，参与细胞分化、凋亡、转录调控和信号转导等多种生物学过程，而且是宿主 天然免疫系统抵抗病毒感染的重要效应因子。 为了研究TRIM 家族蛋白对流感病毒复制的调控作用，我们通过病毒蚀斑滴定实验检测了30 种不同TRIM 家族蛋白对流感病毒复制的影响，发现了多个具有抗流感病毒作用的TRIM 家族蛋 白，并且选择TRIM35 作为深入研究的对象。利用IFN-β 和ISRE 启动子报告基因系统，我们验 证了TRIM35 在天然免疫信号通路中的正调节作用。研究发现，过表达TRIM35 能够抑制流感病 毒复制，siRNA 干扰下调或敲除TRIM35 表达能够促进流感病毒复制。另外，我们建立了Trim35 基因敲除小鼠模型，利用A/WSN/33 (H1N1)病毒感染后，发现与野生型对照组小鼠相比，TRIM35 基因敲除小鼠体重下降更加明显直至全部死亡，而野生型小鼠全部存活。而且，病毒在基因敲除 小鼠肺脏中复制滴度显著提高，导致更加严重的病理变化。 我们通过对RIG-I 信号通路中的主要节点分子进行初步筛选确定了TRIM35 作用的靶点蛋白 —TRAF3，免疫共沉淀（co-IP ）实验验证了二者之间的相互作用，而且通过构建一系列截短突变 体确定了二者结合的关键结构域为：TRIM35 的PRY/SPRY 结构域和TRAF3 的RING 结构域。 此外，我们发现TRIM35 通过对TRAF3 进行K63 泛素化修饰而对RIG-I 信号通路发挥正调控作 用，并且TRIM35 的C36 和C60 位点是对TRAF3 发挥K63 泛素化修饰的关键位点。另一方面， 我们通过co-IP 实验发现流感病毒的10 个主要蛋白中仅有PB2 蛋白与TRAF3 之间存在相互作用， 并且发现病毒的PB2 蛋白能够通过阻碍TRAF3 的K63 泛素化修饰从而抑制RIG-I 信号通路的传 递，进而抑制VISA-TRAF3 复合物的形成。 最后，我们发现TRIM35 与流感病毒PB2 蛋白之间也存在相互作用，而且TRIM35 可以对病 毒PB2 蛋白进行K48 泛素化修饰而导致其通过蛋白酶体途径降解，从而抑制病毒核糖核蛋白复 合体（vRNP ）活性和病毒复制。进一步研究发现，TRIM35 的RING 结构域是发挥抗病毒活性的 关键区域，PB2 的736 位点则是TRIM35 进行K48 泛素化修饰的关键位点。 综上所述，我们利用体外和体内实验揭示了TRIM35 蛋白通过双重机制在RIG-I 天然免疫和 抗流感病毒感染中发挥的新作用，为抗流感药物的研发提供了新的思路。 关键词：A 型流感病毒，TRIM35 蛋白，TRAF3 蛋白，PB2 蛋白，泛素化 I Abstract Influenza A virus (IAV) is an enveloped virus with a segmented genome consisting of eight single-stranded, negative-sense RNAs. The worldwide prevalence of IAV has caused major public health security problems and posed severe threat to the survival and development of humans. Like all other viruses, IAV interacts directly or indirectly with a large number of host proteins in the virus life cycle. Identifying host factors t