PEDV感染Vero E6细胞mRNA_miRNA表达谱分析及Abl2影响病毒复制机制研究.pdfVIP

摘 要 猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus ）属于α 冠状病毒，可引起仔猪产生急性 的、高度接触性肠道传染病。PEDV 的感染会导致宿主细胞mRNA 与 miRNA 表达水平动态的变 化，并与病毒形成复杂的作用网络。全面的分析差异表达宿主因子对 PEDV 复制的调控，有助于 完整地掌握病毒感染后细胞组分、生物学功能、信号通路的变化规律，了解 PEDV 的致病机制， 筛选影响病毒入侵、调控病毒复制的宿主因子。 Vero E6 细胞是 PEDV 分离、传代和进行实验研究的主要细胞。本研究通过对感染 PEDV 弱 毒株 CV777 与强毒株 LNct2 的Vero E6 细胞进行 RNA 高通量测序，分析细胞内mRNA 及 miRNA 的差异表达情况。与对照组相比，CV777 感染组筛选出 33 个差异表达基因，LNct2 感染组筛选 出 1854 个差异表达基因，两组共有的差异基因为 16 个。miRNA 测序结果显示 CV777 感染组共 产生 23 个差异表达 miRNA ，LNct2 感染组共产生 70 个差异表达 miRNA ，两组共有的差异表达 miRNA 为 10 个。对差异表达的宿主因子进行生物信息学分析，结果显示差异表达因子主要富集 在调控细胞内信号转导、细胞代谢、细胞凋亡等通路上，干扰素刺激因子 APOBEC3 、OASL、 MX2、IFITM3 等均下调表达，提示 PEDV 通过拮抗 IFN 抗病毒分子的表达从而逃逸宿主先天性 免疫反应。另外，RNA-seq 测序结果显示 PEDV 感染激活 MAPK 等信号通路。 进一步研究发现 PEDV 感染后上调表达的宿主因子 Abl2 可以影响病毒的复制。Abl2 是一种 非受体酪氨酸激酶，调控细胞多种生命进程。通过 western blot 、测定TCID50 试验发现，沉默 Abl2 后病毒 N 蛋白的表达、病毒滴度均显著下降。应用 Abl2 特异性抑制剂 imatinb、GNF2、GNF5 均可以显著抑制 PEDV 复制，并随着抑制剂工作浓度的增加抗病毒效果越明显，提示 Abl2 参与 了病毒的复制过程。通过在病毒感染的不同时间加入Abl2 特异性抑制剂，证明 Abl2 影响 PEDV 复制主要发生于病毒入侵阶段，但不影响病毒的吸附过程。同时，加入 Abl2 抑制剂后通过间接 免疫荧光观察病毒诱导细胞形成的合胞体明显变小，合胞体数量也减少。外源性表达 PEDV S 蛋 白后加入Abl2 抑制剂实验进一步确定了 Abl2 影响 PEDV S 蛋白介导的细胞间合胞体的形成从而 促进病毒的复制。另外，Abl2 酶抑制剂 imatinb、GNF2、GNF5 对猪肠道冠状病毒具备广谱性抑 制作用，加入抑制剂后可以显著抑制 TGEV 、PDCoV 在 ST 细胞中的感染，并同样抑制病毒的入 侵及细胞合胞体的形成。为研究 PEDV 感染过程中 Vero E6 细胞差异表达的 miRNA 对病毒的调 控作用，应用 miRNA mimic/inhibitor 实验筛选影响 PEDV 复制的 miRNA 。结果发现miR-486-5p、 miR-339-5p、miR-1271-5p 可以显著抑制病毒复制，而miR-33a 可以促进病毒复制。应用RT-qPCR、 双荧光素酶报告系统等手段筛选出 miR-486-5p 在 PEDV 感染过程中起调控作用的靶基因是 SRSF3，上调表达 SRSF3 促进病毒的感染而沉默 SRSF3 抑制病毒的复制。另外 SRSF3 并不是通 过与 PEDV N 蛋白发生相互作用而影响病毒复制，其具体机制有待进一步探索。 本研究构建了 PEDV 感染 Vero E6 细胞 mRNA/miRNA 表达谱，并发现 Abl2 在 PEDV 入侵阶 段发挥调控作用，同时筛选出影响 PEDV 复制的 miRNA ，对挖掘新的 PEDV 药物靶点进而提供 新的抗病毒策略具有重要的借鉴意义。 关键词：猪流行性腹泻病毒，mRNA/miRNA 表达谱，Abl2 ，miR-486-5p，SRSF3 II Abstract Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) belongin