SARS-CoV刺突蛋白嵌合型重组VSV的构建与免疫原性研究.pdfVIP

摘 要 重症急性呼吸综合征（Severe acute respiratory syndrome, SARS ）是由重症急性呼吸综合征病 毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV ）引起的一种急性，发热，并伴有呼 吸道感染等严重并发症的致死性传染病。该病传播速度快、死亡率高，且尚无有效的抗病毒药物 和商业化疫苗。虽然从2004 年以来没有新的 SARS 感染病例报道，但是该病仍然有再次流行的 可能，进而严重威胁民众的健康。2019 年 12 月我国湖北省武汉市爆发了由SARS-CoV-2 引起的 COVID-19 疫情，研究表明该病毒是一种类SARS 样新型冠状病毒，说明SARS-CoV 依然存在突 破物种屏障并通过中间宿主传染给人类的潜在危险，因此研发SARS-CoV 储备型疫苗对我国防控 SARS 具有十分重要的意义。 SARS-CoV 是冠状病毒科（Coronaviridae）、β -冠状病毒属（β -Coronavirus）成员。刺突蛋白 （Spike protein, S）是SARS-CoV 的跨膜糖蛋白，主要负责与细胞受体结合、诱导病毒与细胞融 合以及刺激机体产生免疫应答等，是SARS-CoV 最重要的免疫原性蛋白。 水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV ）是弹状病毒科（Rhabdoviridae ）、水泡病毒 属（Vesiculovirus）成员。VSV 作为重组病毒疫苗载体具有很多优点：VSV 是一种RNA 病毒，其 基因组不会整合到宿主细胞中；VSV 增殖速度快、滴度高，单次免疫就能产生有效保护；插入的 外源基因稳定并且表达效率高；VSV 对普通人群的致病性极低，具有较高的安全性。 本研究以实验室成功构建的嵌合型 VSV 反向遗传操作系统为基础，将 VSV 的嚢膜糖蛋白 （Glycoprotein, GP ）替换为SARS-CoV S 蛋白，成功拯救出重组病毒并分别命名为VSVΔG-SARS 和VSVΔG-eGFP-SARS。Western blot 和激光共聚焦实验证明重组病毒可以正确表达SARS-CoV S 蛋白，间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay, IFA ）结果显示重组病毒依赖宿主细 胞的细胞受体血管紧张素转换酶2 （Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2 ）完成入侵，进一步表 明SARS-CoV S 蛋白在重组病毒中成功表达。通过电镜发现重组病毒呈现弹状病毒的典型形态， 同时S 蛋白嵌合在重组病毒嚢膜表面。病毒的生长动力曲线结果表明重组病毒的滴度低于亲本毒 wtVSV，但仍然可以满足免疫滴度的需要。在小鼠的安全评价实验中小鼠未表现出任何临床症状， 初步说明重组病毒对小鼠具有良好的安全性。在免疫效力评价中，首先通过中和试验和ELISA 实 验证明重组病毒能刺激小鼠产生较高水平的体液免疫，进一步通过 ELISPOT 实验证明重组病毒 也可以诱导恒河猴较强的细胞免疫应答，表明重组病毒具有良好的免疫原性。 本研究利用 VSV 嵌合型反向遗传系统，成功制备了嵌合型重组病毒 VSVΔG-SARS 和 VSVΔG-eGFP-SARS，并利用小鼠和恒河猴对VSVΔG-SARS 的免疫原性进行评估，证明该重组 病毒具有作为SARS-CoV 储备型疫苗的潜在价值，同时也为研发以VSV 为载体SARS-CoV-2 的 疫苗提供了可行性。 关键词：水泡性口炎病毒，重症急性呼吸综合征病毒，刺突蛋白，囊膜糖蛋白，重组病毒载体疫 苗 I Abstract Severe acute respiratory syndrome (SARS) is an acute, febrile and fatal infectious disease which caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Although there are no m