O型口蹄疫病毒抗体及3ABC抗体快速检测化学发光法的建立.pdfVIP

摘 要 口蹄疫（FMD ）是由口蹄疫病毒（FMDV ）引起的一种急性、热性、高度接触传染性的 动物疫病，对养殖业和畜产品贸易造成严重的影响。在发展中国家，控制和根除口蹄疫主要 是依赖疫苗。尽管在灭活疫苗制备过程中，一系列纯化方法被用于去除病毒的非结构蛋白 （NSPs ）组分，但有报道表明灭活疫苗多次免疫牛后，仍能够检出 NSPs 抗体，这对区分 FMDV 感染与疫苗免疫动物造成很大的干扰，因此，开发一种定量检测疫苗中NSPs 残留的 方法是非常必要的；同时，也需开发一种敏感、快速的检测方法用于区分FMDV 感染与疫 苗免疫动物。此外，建立区分口蹄疫血清型的检测方法对评价口蹄疫疫苗免疫效果、指导防 控与建立科学的免疫程序具有重要意义。 1. FMDV NSPs 3ABC 三个线性B 细胞表位的鉴定 本研究对获得的FMDV NSPs 3ABC 三株单克隆抗体 （2G5、9E2 和1E10）所识别的表 92 97 位进行了鉴定，结果表明 2G5 、9E2 和 1E10 识别的最小表位分别是 “EYIEKA ”， 23 31 209 212 “EGPYAGPLE ”和“ EPHH ”。丙氨酸突变确定了三个表位中的关键氨基酸位点。序 列比对结果表明2G5 识别的表位相对保守，9E2 识别的表位在3B2 中是高度保守的，1E10 识别仅由4 个氨基酸组成的表位。对单抗特性的研究，为将其应用于区分感染与免疫以及评 估疫苗中NSPs 残留奠定了理论基础。 2. 检测FMDV NSPs 抗体的单抗竞争化学发光方法 （3A+3B CLIA ）的建立 利用兔抗3ABC 抗体捕获3ABC 蛋白建立了检测FMDV NSPs 抗体的单抗竞争化学发 光法。通过检测背景清楚的猪、牛、羊血清确定了该方法检测猪、牛、羊血清的Cut-off 值 （分别为40%、40%、50% ），诊断敏感性（98.13%、95.71%、96.15% ）和诊断特异性（99.51%、 99.43%、98.36% ），仅需15 min 出结果。该方法不受动物种属的限制，口蹄疫易感动物通用， 且快速、简便（只洗涤一次）。 3. 口蹄疫灭活抗原及灭活疫苗中NSPs 残留检测方法的建立 将兔抗 3ABC 抗体作为固相捕获抗体，9E2-HRP 作为检测抗体，建立了一种定量检测 口蹄疫灭活抗原和灭活疫苗中NSPs 的化学发光法，并筛选出能用于该检测方法的最佳破乳 法。此外，通过WB 确定了灭活抗原和灭活疫苗中3B 蛋白主要以3AB 、3ABB 和3ABBB 三种形式存在。 4. 猪FMDV O 型抗体间接化学发光检测方法的建立 利用重组多表位蛋白建立了一种检测猪FMDV O 型抗体的间接化学发光法（M2-CLIA ）。 通过检测背景清楚的血清确定了该方法的Cut-off 值，诊断敏感性和诊断特异性。当PP ≥3.5%， 判定为口蹄疫O 型抗体阳性；2.2%≤PP ＜3.5%，判定为可疑；PP ＜2.2% ，判定为口蹄疫O 型抗体阴性。该方法灵敏度高，型内广谱性好，特异性好。通过O-LPBE 的抗体效价间接判 定出 M2-CLIA 检测灭活疫苗的免疫保护值，通过用表位苗免疫后攻毒的临床症状判定出 M2-CLIA 检测表位苗的免疫保护值。 关键词：口蹄疫，非结构蛋白，单克隆抗体，重组多表位蛋白，化学发光法 I Abstract Foot-and-mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious animal disease, which is caused by Foot-and-mouth disease virus (FMDV), and has led to serious losses in the farming industry and the trade of animal products. In developin