F基因起始密码子突变对ClassⅠ类NDV生物学特性的影响.pdfVIP

摘 要 新城疫（Newcastle disease ，ND ）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus ，NDV ）引起禽类 的一种高度接触性传染病。近年来，流行病学研究表明class I 类NDV 已在我国广泛分布，其持 续的传播和流行可能使病毒变异，存在毒力增强的风险。 对2017 年中国19 个省市分离到的多株class I 类NDV 进行全基因组测序，发现几株病毒的 F 基因起始密码子突变为ATA 与CTA 。其中，FJ28 毒株分离自福建省某鸭群，遗传演化分析发 现其属于class I 类基因3 型，与经典class I NDV 相比，FJ28 毒株F 基因起始密码子由ATG 突变 为了ATA ，其起始密码子前移了33 个核苷酸，导致F 基因编码区长度为 1695 个核苷酸，编码 564 个氨基酸，但其他基因长度未发生改变。毒力指标测定结果显示，FJ28 毒株的鸡胚死亡平均 时间（Mean death time ，MDT ）为74h ，1 日龄SPF 雏鸡脑内接种致病指数（Intracerebral pathogenicity index ，ICPI ）为1.413，表明FJ28 为中等毒力毒株。而经典class I 类NDV 为低毒力，推测FJ28 毒株毒力增强可能与F 基因起始密码子的突变导致编码序列变长有关。 为验证以上推论，利用反向遗传学技术将class II 类La Sota 弱毒株的F 基因替换为FJ28 毒 株的F 基因，救获了重组病毒La Sota-FJ28F 。毒力指标测定结果显示，其ICPI 值为0.7321 ，高 于亲本弱毒株La Sota 的0.19 ，为中等毒力，表明F 基因的替换导致La Sota 毒力增强。进一步将 La Sota 弱毒株的F 和HN 基因同时替换为FJ28 毒株的F 和HN 基因，获救重组病毒La Sota- FJ28FHN 。毒力指标测定结果显示，其ICPI 值为0.736 ，表明La Sota-FJ28FHN 为中等毒力，且 与La Sota-FJ28F 无显著差别。另外，La Sota-FJ28FHN 的MDT 为126 h ，但接种后存活的鸡胚有 明显的出血和损伤。上述结果表明HN 基因的替换没有明显导致La Sota-FJ28F 毒力增强，即F 基 因的替换是导致La Sota-FJ28FHN 毒力增强的关键因素。将重组病毒La Sota-FJ28FHN 的F 基因 起始密码子ATA 突变为ATG ，获救重组病毒La Sota-FJ28FHN-F-ATG 。毒力指标测定结果显示， 其ICPI 值为0.238 ，表明F 基因起始密码子突变为ATG 是导致重组病毒La Sota-FJ28FHN-F-ATG 毒力降低的原因。 为证实FJ28 中F 基因起始密码子突变是导致其毒力增强的决定因素，本研究建立了FJ28 毒 株的反向遗传操作系统，救获了FJ28 亲本毒株，并将其F 基因起始密码子回复突变为ATG ，救 获了突变病毒FJ28FL-ATG 。由于NDV 流行病学调查中发现部分class I 类NDV F 基因起始密码 子突变为CTA 。为评价F 基因起始密码子突变为CTA 对NDV 生物学特性的影响，本研究进一 步救获了突变病毒FJ28FL-CTA，毒力指标测定结果表明，FJ28、FJ28FL-ATG 和FJ28FL-CTA 的 ICPI 分别为0.875、0.266 和0.406，表明FJ28 为中等毒力毒株，而FJ28FL-ATG 和FJ28FL-CTA 为低毒力。另外，FJ28 、FJ28FL-ATG 与FJ28FL-CTA 的MDT 分别为136 h 、134 h 和121 h ，均 大于90 h ，但亲本病毒FJ28 接种后存活的鸡胚出血、损伤情况严重，而FJ28FL-ATG 和FJ28FL- CTA 并未造成鸡胚出血或损伤。这一结果证实F 基因起始密码子突变为ATA 导致的编码氨基酸 变异是FJ28 毒力增强的关键因素。另外，本研究测定了FJ28 、FJ28FL-ATG 和FJ28FL-CTA 在鸡 胚中的生长曲线，结果显示三株病毒具有相似的生长动力学特性，但其中FJ28 的增殖速度最快， 在各时间点具有更高的生长滴度。上述结果表明class I 类NDV FJ28 F 基因起始密码子突变是导 致FJ28 在毒力和生长特性等方面与其他class I 类NDV 弱毒株不同的关键原因。