E2蛋白介导的猪瘟兔化弱毒疫苗适应家兔的分子机制.pdfVIP

摘 要 病毒在非易感细胞或宿主中连续传代后，适应非易感细胞或宿主，同时在自然宿主中的毒力 减弱，从而获得弱毒疫苗。猪瘟兔化弱毒疫苗 （C 株或HCLV 株）是在20 世纪50 年代将猪瘟病 毒强毒株在家兔体内连续传480 余代获得的一株弱毒疫苗。与猪瘟强毒Shimen 株相比，C 株能 够适应家兔，对猪无致病性。本实验室前期发现，E2 蛋白是C 株适应家兔的关键蛋白。那么， E2 蛋白是如何介导C 株适应家兔的？决定猪瘟病毒适应家兔的分子基础是否影响病毒在猪体内 的毒力？ 为解析E2 蛋白介导的C 株适应家兔的分子机制，首先确定了C 株适应家兔的E2 蛋白关键 氨基酸。以C 株为骨架构建了包含Shimen 株E2 蛋白不同结构域的嵌合病毒，通过家兔接种试验 发现位于E2 蛋白Domain I 是C 株适应家兔的关键结构域。下一步，对Domain I 中的差异氨基 酸进一步分析，发现Domain I-2 中的三个氨基酸位点（K105 、P108 和T109 ）能够决定C 株对家 兔的适应性。那么这三个位点中具体哪个氨基酸在C 株适应家兔中发挥作用呢？因此，构建了单 独突变和两两组合突变的突变体病毒，通过家兔接种试验发现，P108 和T109 是C 株适应家兔的 E2 蛋白关键氨基酸。接下来，以不能适应家兔的嵌合病毒（vSM-HCLVErns ）为骨架，构建了包 含 C 株的 E2DomainI 、E2DomainII 或 E2P108-T109 的三株嵌合病毒来分析 C 株 E2P108-T109 能否使 vSM-HCLVErns 适应家兔。家兔试验结果显示，E2DomainI 或 E2P108-T109 而不是 E2DomainII 能够使 vSM-HCLVErns 适应家兔，说明C 株的E2P108-T109 与Erns （E2P108-T109-Erns ）能够赋予Shimen 株适应 家兔的能力。同时，我们发现家兔脾脏淋巴细胞是C 株感染家兔脾脏的靶细胞。之后，将亲本病 毒（Shimen 株和 C 株）和嵌合病毒（vSM-HCLVErnsE2DomainI 、vSM-HCLVErnsE2DomainII 和 vSME2L108P-I109T-HCLVErns ）感染分离的家兔原代脾脏淋巴细胞。结果显示，家兔适应毒（C 株、 vSM-HCLVErnsE2DomainI 和vSME2L108P-I109T-HCLVErns ）感染家兔原代脾脏淋巴细胞后随着时间的延 长其基因组拷贝数逐渐增加，而家兔非适应株（Shimen 株和vSME2L108P-I109T-HCLVErns ）的基因 组拷贝数逐渐减少，进一步证明，C 株的E2P108-T109-Erns 能够赋予Shimen 株感染家兔脾脏淋巴细 胞的特性。同时，在原代猪巨噬细胞上分析亲本病毒和嵌合病毒的生长特性。结果表明，与亲本 病毒 Shimen 株相比，嵌合病毒（vSM-HCLVErnsE2DomainI 、vSM-HCLVErnsE2DomainII 和 vSME2L108P-I109T-HCLVErns ）在细胞内的基因组拷贝数无显著差异，而C 株的基因组拷贝数在感染 后24 h 逐渐减少；而嵌合病毒在细胞上清中的毒价显著低于亲本病毒Shimen 株在细胞上清中的 毒价。 由于E2 糖蛋白与病毒侵入靶细胞和病毒嗜性有关，因此我们构建了基于亲本病毒和嵌合病 毒的伪型病毒来分析 C 株 E2P108-T109-Erns 对病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞的影响。结果证实，基于 家兔适应毒的伪型病毒能够侵入家兔脾脏淋巴细胞，而以家兔非适应毒为模板的伪型病毒不能够 侵入家兔脾脏淋巴细胞，说明 C 株 E2P108-T109-Erns 通过促进猪瘟病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞来提 高病毒对家兔的适应能力。然而，不同伪型病毒在侵入猪源SK6 细胞时没有差异。最后，分析了 关键氨基酸是否影响猪瘟病毒在猪体内的毒力。与强毒 Shimen 株相比，家兔适应毒 （vSM-HCLVErnsE2DomainI 和vSME2L108P-I109T-HCLVErns ）的毒力未发生显著性改变，而家兔非适应 毒（vSM-HCLVErnsE2DomainII ）的毒力减弱。 I 综上所