HMGB1_TLR2对奶牛卵巢颗粒细胞排卵相关基因的影响及姜黄素对其干预作用.pdfVIP

摘 要 卵巢疾病是导致奶牛繁殖障碍的重要原因之一。深入探讨奶牛卵巢生理功能和发病学机制， 可为奶牛卵巢疾病更加合理治疗方案的制定和靶向治疗药物的筛选提供科学依据。大量研究证明， 哺乳动物排卵过程类似于炎症，先天免疫在其中发挥着重要作用。TLRs 是动物先天免疫系统中 一类具有重要功能的 PRRs ，已被证明存在于多种哺乳动物卵巢组织，在卵巢生理活动和卵巢相 关疾病发生发展过程中发挥重要作用。随着人们对TLRs 在卵巢先天免疫研究方面的深入，TLR2/4 的内源性配体HMGB1 在卵泡液中的作用引起了研究者的兴趣。但是到目前为止，HMGB1 和TLRs 在卵巢活动及相关卵巢疾病中的功能还不甚明确，其在奶牛卵巢颗粒细胞中的作用研究报道较少。 本论文以原代奶牛卵巢颗粒细胞为对象，采用qRT-PCR 、免疫印迹、免疫组化、免疫共沉淀、 间接免疫荧光、ELISA 和基因沉默等技术，研究了HMGB1 和TLR2 在不同发育阶段卵泡来源的 颗粒细胞中的表达规律及调控其表达的因素，分析了HMGB1/TLR2 对排卵相关基因的影响及姜 黄素通过HMGB1/TLR2/NF-κB 对排卵相关基因的干预作用。结果表明：来源于不同发育阶段的 健康卵泡颗粒细胞均可高表达 TLR3、TLR1、TLR6、TLR2、TLR10 和 HMGB1 ，低表达TLR4 和TLR5，不表达TLR7/8/9，TLRs 和HMGB1 的表达水平随着卵泡的发育呈逐渐升高趋势；TLR2 分别与HMGB1 、TLR1 和TLR6 之间存在交叉对话，这种对话也会随着卵泡的发育呈增强趋势； 用5 种浓度的FSH 刺激卵巢颗粒细胞6 hr，其中12.5、25、50 mIU/mL FSH 不会抑制细胞活性， 25 和50 mIU/mL FSH 能显著上调HMGB1、TLR2、TLR1、TLR6 和 MyD88 的表达水平，12.5、 100 和500 mIU/mL FSH 对这些蛋白的调节作用不明显。在细胞培养液中加入0.2、1 和5 μg/mL HMGB1 孵育6 hr 后， 5 μg/mL HMGB1 能显著上调卵巢颗粒细胞内TLR2、EGFR 、VEGF 、StAR、 TIMP1/2 的mRNA 水平与TLR2、TLR1、TLR6、p-NF-κB p65 蛋白水平，引起细胞NF-κB p65 发生核易位和大量分泌IL-6；HMGB1 分别与TLR2、TLR1、TLR6 和p-NF-κB p65 之间存在交叉 对话，对话强度与HMGB1 有剂量依赖性，siRNA 靶向基因沉默TLR2 能显著逆转HMGB1 引起 的上述变化。分别用1.25、2.5 和5 μg/mL 姜黄素预孵育卵巢颗粒细胞6 hr，再用5 μg/mL HMGB1 孵育卵巢颗粒细胞6 hr 后，5 μg/mL 姜黄素能显著下调HMGB1 引起的TLR2 与排卵相关基因的 mRNA 水平变化、显著下调TLR2、TLR1、TLR6 和p-NF-κB p65 蛋白水平、抑制NF-κB p65 的 核易位和IL-6 的分泌，降低HMGB1 与TLR2、TLR1、TLR6 和p-NF-κB p65 的交叉对话。 综上所述，奶牛不同发育阶段的卵泡颗粒细胞能表达TLRs 家族成员和HMGB1 ，表达水平 与卵泡发育程度有相关性；FSH 对卵巢颗粒细胞 HMGB1 和 TLR2 的表达有一定调控作用； HMGB1 能通过TLR2 激活颗粒细胞中的NF-κB 信号通路，刺激细胞大量分泌IL-6，进而影响排 卵相关基因表达；姜黄素干预能显著逆转HMGB1 对TLR2/NF-κB 的激活，抑制IL-6 的分泌，影 响排卵相关基因的表达。HMGB1 可以作为评估卵泡发育程度的指示性指标及治疗卵巢相关疾病 的潜在性靶点，但仍需深入研究。 关键词：奶牛，卵巢颗粒细胞，HMGB1 ，TLR2 ，姜黄素 I Abstract Ovarian disease is one of the most important causes of reproductive disorders in dairy cows. To investigate the physiological function a