NGS技术在转基因作物分子特征解析中的应用前景分析.pdfVIP

摘 要 分子特征是指转基因植物中外源 DNA 片段在受体基因组中的整合、表达以及遗传稳定性等 方面的信息，主要内容有插入外源基因的拷贝数、插入位点的侧翼序列、插入序列的完整性、是 否有载体骨架序列的插入等。分子特征是研发者筛选和鉴别转化体重要依据，也是转基因植物安 全评价的主要内容。目前，插入外源基因的拷贝数可以通过 Southern 杂交、荧光定量 PCR 或数 字 PCR 等方法进行解析，插入位点和侧翼序列可以通过基于 PCR 的染色体步移技术获得。这些 技术适用于解析外源插入片段整合情况比较简单的转基因作物的分子特征，但对于 同一位点插入 多个拷贝等复杂整合情况、包含多个外源基因的复合性状转基因作物、以及应用基因编辑和合成 生物学等技术研发的新型转基因作物的分子特征的解析往往不够精准。 随着 DNA 测序技术的发展和大数据时代的到来，NGS （Next Generation Sequencing ）技术 以 其高通量、灵敏度高、可操作性强、和可重复性强等特点，为精准解析转基因植物的分子特征提 供了新的技术方案。本研究在对 NGS 测序技术的发展、NGS 技术在转基因植物分子特征解析中 的应用、以及国外转基因植物安全评价中对高通量测序数据的要求等背景调研的基础上，总结了 NGS 技术解析转基因作物分子特征的技术方法，对 NGS 测序和传统方法解析转基因作物分子特 征的技术原理与结果进行了系统的比较，并将 NGS 不同测序平台的测序结果及数据处理方式进 行了对比。主要研究内容与结果如下： 1. 建立了 NGS 技术解析转基因作物分子特征的技术方法。以转基因抗草甘膦水稻 G2-7 转化 体及其亲本中花 11 为样本，利用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行全基因组测序，共获得了 129.72 Gb 的测序数据，通过与水稻参考基因组和转基因载体序列的比较，确定了 G2-7 转化事件的外源 基因为单拷贝插入，无质粒骨架的插入，插入位点为水稻 Oryza sativa Japonica Group 1 号染色体, 造成了水稻基因组 16 bp 的缺失和插入外源 DNA 参考序列两端共 49 bp 的缺失，并用序列拼接的 方法找到了插入位置左右分别 375 bp 和 353 bp 的侧翼序列，证明了使用 NGS 技术和生物信息学 方法相结合的方法，能够为评估转基因植物的安全性提供节省时间和成本的有效方法。 2. 对整合情况较为复杂的转化体的分子特征解析 。用 Illumina HiSeq 4000 平台对转基因抗草 甘膦水稻 G2-6 转化体及其亲本中花 11 进行全基因组测序，深度分别为 20 ×、30 ×、40 ×、70 ×，共获得了 149.35 Gb 的测序数据，用 PacBio Sequal 平台对抗草甘膦水稻 G2-6 转化体及其亲 本中花 11 进行全基因组测序，数据量为 20 Gb 。通过 Illumina 平台和 PacBio 平台测序结果结合 的方法对 G2-6 转化体进行了分子特征解析，确定了 G2-6 转化事件的外源基因为单拷贝插入，无 质粒骨架的插入，插入位点为水稻 Oryza sativa Japonica Group 8 号染色体，造成了水稻基因组 31 bp 的缺失和插入外源 DNA 参考序列两端共 69 bp 的缺失，将 Illumina 和 PacBio 的测序数据结合 分析，获得了传统方法无法获得的插入位点左右两端分别为 278 bp 和 773 bp 的侧翼序列，并发 现了 G2-6 转化体 3 ’端的一段 482 bp 的非预期插入序列，说明 PacBio 测序平台在解决复杂的外 源 DNA 串联、重复等情况有独特的优势 。 3. 对 NGS 测序技术在转基因安全评价中的应用过程 中的一些技术方法进行了比较，包括不 同的测序平台、不同的数据分析软件以及不同测序深度进行了对比，本研究中使用 Illumina 和 PacBio 测序结果进行分子特征解析能够得到拷贝数、插入位点、载体骨架插入方面一致的结论， I 对于复杂转化体的侧翼序列，可以用 PacBi