K亚群禽白血病病毒细胞受体及受体结合域鉴定.pdfVIP

摘 要 K 亚群禽白血病是由K 亚群禽白血病病毒（Subgroup K Avian Leukosis Virus, ALV-K ）引起 的一种禽类肿瘤病。ALV-K 是一种新的病毒亚群，2012 年首次发现于我国本地鸡群。随后，在 我国南方多个地方品种鸡群中分离发现该病毒。该病毒感染后，可损伤免疫系统，引起严重免疫 抑制，并能诱导产生神经胶质瘤。然而，目前ALV-K 侵入宿主细胞机制以及侵入后引起的致病 机制尚不清楚。病毒囊膜蛋白上的受体结合域与细胞受体相互作用是介导禽白血病病毒感染的首 要步骤。为阐明ALV-K 的侵入机制，本研究鉴定了ALV-K 的细胞受体和gp85 上的受体结合域。 为鉴定ALV-K 的细胞受体，本研究首先将ALV-K gp85 与其他常见外源性ALV gp85 蛋白 进行氨基酸序列同源性分析，发现ALV-K gp85 与ALV-A 同源性最高，为80.8%。然后进行了交 叉干扰实验，结果表明A 亚群ALV （ALV-A ）gp85 蛋白能够抑制ALV-K 的感染，同样ALV-K gp85 蛋白也能抑制ALV-A 的感染，存在交叉干扰现象，因而推测ALV-K 可能利用ALV-A 的细 胞受体Tva 进入细胞。为验证这一假说，本研究利用Co-IP 和Pull-down 实验检测了ALV-K gp85 与Tva 的互作，结果表明，ALV-K gp85 蛋白能与可溶性的Tva （soluble Tva, sTva ）相互作用。 受体结合实验结果表明ALV-K gp85 能高效结合跨膜表达的Tva ，结合率在90% 以上。受体阻断 实验结果表明，sTva 浓度从1.6 µg/mL 开始可显著阻断病毒进入。受体重建实验结果表明RCAS- K-GFP 能够进入表达Tva 的非易感细胞（293T ）并复制产生较强的GFP 荧光。以上结果充分表 明Tva 是ALV-K 的细胞受体，能够介导ALV-K 进入宿主细胞，启动感染。 有文献报道ALV-A 、B 、C 和E 亚群的gp85 与细胞受体的相互作用主要发生在宿主决定区 hr 1 （host range region1, hr1 ）和hr2 。为进一步鉴定ALV-K 的受体结合域，本研究采用HA 标签 逐段替换策略，将hr 1 （T120~E 160）分别按照从前往后顺序依次进行5 次替换，hr2 （Q194~K240 ） 进行3 次替换，共构建了8 组可溶性表达质粒。将野生型gp85 及HA 替换的gp85 蛋白进行圆二 色谱测定，结果表明HA2 和HA6~8 替换的gp85 蛋白二级结构与野生型gp85 差异较大。受体结 合实验结果表明，HA2 和HA6~8 替换的gp85 蛋白均丧失了与Tva 结合的能力，结合率低于30%。 病毒阻断实验结果类似于受体结合试验，HA2 和HA6~8 替换的gp85 蛋白均不能有效封闭DF-1 细胞表面受体进而阻断病毒进入。以上结果证明，位于ALV-K gp85 中间1/3 区域的hr 1 中的HA2 （C129~I 137）和hr2 对应的HA6~8 （Q 194~ K240 ）区域的氨基酸构成gp85 上的受体结合域。 为进一步鉴定ALV-K gp85 蛋白结合受体的关键氨基酸，比较了上述受体结合域内不同亚群 ALV 毒株gp85 相应氨基酸序列，根据亚群间不同、亚群内保守的原则，确定了8 组潜在关键氨 基酸位点。为验证这些位点在受体结合中的作用，在gp85-HA2 和HA6~8 蛋白基础上回复突变上 述氨基酸，构建了8 组gp85-HA 回复突变体质粒。受体结合实验结果表明，gp85-HA6R198 、gp85- HA6R200C201G202 与 Tva 相对结合能力分别可以达到 60%和 75% 。这些结果表明 ALV-K gp85 的 R198 和R200C201G202 位氨基酸在结合受体中发挥关键作用。 本研究鉴定了ALV-K 的细胞受体及gp85 受体结合域，并鉴定出决定ALV-K 结合Tva 受体 的关键氨基酸。这些研究结果为阐明ALV-K 侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选奠定了基础。 关键词：K 亚群禽白血病病毒，细胞受体，受体结合域，关键氨基酸 I Abstrac