CRISPR_Cas12a系统介导的水稻基因编辑和定点基因替换体系的构建及优化.pdfVIP

摘 要 作为世界上最重要的粮食作物之一，水稻生产关系到我国乃至世界的粮食安全。随着人口增 长、全球气候变暖、耕地面积和水资源减少，我国水稻生产面临着巨大挑战。以CRISPR/Cas 系 统为代表的基因编辑技术可对靶标基因进行定点敲除、插入、替换等。大多数农作物优异等位基 因差异主要是少数几个碱基或小片段插入/缺失引起，通过基因编辑介导的同源重组技术，可快速 实现优异等位基因精准替换，大大缩短育种周期。但由于同源重组发生概率极低，特别是植物细 胞含有细胞壁，无法将足量的修复模板递送到细胞中，CRISPR/Cas 介导的等位基因替换效率偏 低，成功报道较少，已成为利用基因编辑进行农作物等位基因替换的技术瓶颈和该领域的研究热 点及竞争焦点。CRISPR/Cas12a (Cpf1)属于II 类type V CRISPR 系统，具有组装简单、脱靶效率 低等优点，但识别的5’-TTTV-3’ PAM 限制了CRISPR/Cas12a 的应用范围。此外，CRISPR/Cas12a 产生的交错切割可能会促进同源重组的发生，但在植物中尚未有利用CRISPR/Cas12a 进行等位基 因替换的报道。本论文从以下几方面进行了研究，并取得如下进展： 1) 构建了 CRISPR/Cas12a 介导的水稻基因编辑体系，并扩展 CRISPR/Cas12a 系统在水稻中的 应用范围：利用LbCas12a 的G532R/K595R 突变体LbCas12a (RR)和G532R/K538V/Y542R 突变体LbCas12a (RVR)，以水稻OsPDS 和OsSBEIIb 为靶标基因，检测突变体的编辑效果。 结果表明，在水稻中，LbCas12a (RR)可通过识别5’-TYCV-3’ PAM (其中Y=T\C ；V=A\G\C) 的PAM 实现多基因和多位点编辑，拓展了 LbCas12a 在水稻中编辑范围，编辑效率最高达 51%，对于推进CRISPR/Cas12a 在植物基因编辑研究领域的应用具有重要意义。 2) CRISPR/Cas12a 系统介导的以DNA 为修复模板的水稻定点基因片段替换：以水稻ALS 基因 为靶基因，双链DNA 为同源重组修复模板，通过载体和修复模板共转化，实现了水稻中ALS 基因的片段替换，创制出抗除草剂水稻新种质。同时，当只有左侧同源臂时，仍然可实现同 源重组。初步明确了当有修复模板存在时，CRISPR/Cas12a 介导的DNA 双链断裂修复主要 遵循合成依赖修复机制。本研究结果简化了修复模板的设计，可促进利用基因编辑介导的同 源重组在5’ 和3’ 进行基因标记。进一步，利用密码子优化的Cas12a 及OsU3 、OsU6 两个 启动子分别驱动 RCR1 (HH 核酶-CRISRP RNA1-HDV 核酶) 和 RCR2 (HH 核酶-CRISRP RNA2-HDV 核酶) 的方法，一代获得15 株ALS 基因精准替换的纯合植株。以上研究为利用 CRISPR/Cas 12a 系统实现农作物等位基因替换提供了一定的技术支撑。 3) CRISPR/Cas12a 系统介导的以RNA 为修复模板的水稻定点基因片段替换：利用体外RNA 转 录本，采用CRISPR/Cas12a 核糖核蛋白复合体 (Ribonucleoprotein ，RNP) ，基因枪转化水稻 愈伤。然后，通过基因特异性PCR ，证实了RNA 转录本可以作为DNA 修复模板，进行同源 重组修复；进一步，利用微滴式数字PCR 技术，采用RNP 方法，在水稻愈伤中评估了DNA 或/ 和 RNA 模板的修复效率。利用具有核酸酶活性的 HH 核酶和 HDV 核酶单元、 CRISPR/Cas12a 系统crRNA 靶序列间隔DNA 修复模板，采用U3 启动子和Nos 终止子，构 建载体并通过基因枪转化水稻。通过细胞体内转录修复模板，转录本自我加工在细胞核内同 时产生释放crRNA 和RNA 修复模板，实现了水稻ALS 基因片段精准替换。经过后代分离， I 获得无转基因、抗除草剂水稻。建立了CRISPR/Cas 介导、分别以DNA 或/和RNA 转录本作 为修复模板的农作物等位基因替换体系