生物化学实验：第八次试验.docVIP

实验十一 DNA的定量测定-二苯胺法 一．实验目的： 学习并掌握二苯胺法定量测定DNA含量的原理与方法。 二．实验原理 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。 三．实验仪器 试管 移液管 7220分光光度计 四．实验试剂 1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。 2、二苯胺试剂： A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。 B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可 五．实验步骤 1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂： ? 0 1 2 3 4 5 DNA标准液 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 二苯胺试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。 2.样品测定 吸取DNA样液2ml，加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 六、结果与讨论： 1．DNA标准曲线绘制： 根据测定数据，以DNA含量（μg）为横坐标，OD595值为纵坐标，绘制出标准曲线。 0 1 2 3 4 5 样液 OD 1 0．000 0.053 0.131 0.174 0.228 0.288 0.151 OD 2 0．000 0.053 0.129 0.174 0.231 0.290 0.151 OD 3 0．000 0.054 0.128 0.174 0.231 0.292 0.151 OD平均值 0．000 0.0533 0.1293 0.174 0.230 0.290 0.151 2．DNA含量的计算： 当y=0.151时，x=1.050789微克 DNA%=样液中测的DNA量/样液中所含样品量*100% =1.050789/1000000/2*1000=0.0525 七．思考题及注意事项 注意事项： 1. 此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。 2. 样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。 3．注意分光光度计的正确使用。 思考题： 1. 测定DNA含量的方法还有哪些? 1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。 （2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。 2. 实验中加入乙醛的目的? 在试剂中加入少量的乙醛可以提高反应的灵敏度