基因组编辑工具CRISPR-Casl2b_c2cl在植物中的应用探究.pdfVIP

摘 要 摘 要 CRISPR/Cas系统作为第三代基因组编辑技术，具有简单、高效、灵活、低廉等 优点，被广泛应用于多个物种的基因组编辑研究中,成为了生命科学领域的革命性工 具。利用该系统可以实现对基因组目标位点的碱基插入、缺失、替换等操作，及靶 向激活或抑制基因的表达。与此同时，对CRISPR/Cas系统的不断改造以及新型Cas 蛋白的功能开发，使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传修饰工具。 CRISPR-Cas12b/C2c1系统属于class2 中的typeV-B型的基因编辑系统。Cas12b 蛋白具有一个保守的RuvC结构域和一个Nuc 结构域，该蛋白需要crRNA和tracrRNA 的共同引导，识别富含AT 的PAM序列，切割DNA双链，产生5‘粘性末端。 为了验证CRISPR-Cas12b系统能否在植物中起到基因组编辑的作用，我们选择 来自于Bacillussp. V3-13(Bv)和Bacillushisashii(Bh)的Cas12b蛋白在拟南芥原生质 体中进行验证。首先，通过添加核定位信号和密码子优化，实现了两蛋白在拟南芥 PDS3 FLS2 GL2 TT4 原生质体细胞中的入核表达。其次，选择拟南芥 、 、 和 基因为 靶位基因进行基因编辑验证，Cas9蛋白作为对照。通过T7E1检测和深度测序验证 编辑效率和编辑形式，结果显示在所检测位点两蛋白的编辑效率从0%-4.3%不等， 且具有位点效应。编辑形式主要为在切割位点产生5-13bp的片段缺失。同时Cas12b 蛋白可以进行双位点编辑和大片段缺失。并且，脱靶验证显示该蛋白不能容忍大于 3bp的guide错配。最后，通过稳定转化拟南芥植株，成功得到了Cas12b蛋白基因 功能缺失的编辑突变体，证明该蛋白是一种可以在植物中进行基因编辑研究的工具。 关键词： 基因组编辑；CRISPR-Cas12b；C2c1；拟南芥原生质体；深度测序 Ⅰ Abstract Abstract Withsimplicity,efficiency,flexibilityandunexpensive,theCRISPR/Cassystemasthe thirdgenerationofgenomeeditingtool,hasbeenproventobe effectivefortargetedgene editinginawildlyrange oforganismsandbecomestherevolutionarytoolinlifesciences. Inadditiontotargetedinsertion,deletionandsubstitutionapplications,CRISPR/Cassystem also achieves targeted gene activation andsuppression. Furthermore, CRISPR/Cassystem have been improved and expanded by new Cas potein. By these progresses, CRISPR technologyisclosetothedreamtoolforgeneticmanipulation. Cas12bcontainsaconservedRuvCendonucleasedomainandNucdomain.Cas12bis a dual-RNA-guided DNAendonuclease, andboth crRNAand tracrRNA are required for its double-stranded DNA cleavage activity. Cas12b recognizes a AT-rich protospacer adjacentmotif (PAM)sequence located at the 5’-end of a target D