分子医学技能：电泳：重组质粒的酶切鉴定紫外分光光度法检测DNA含量.pptVIP

分光光度计的基本部件 1. 光源 分光光度计上常用的光源有两种： 近紫外光区 可见光区 钨丝灯 近红外光 紫外光区——氢灯、氘灯 光→电 2. 单色器 单色器是把混合光波分解为单一波长光的装置。 棱镜 光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，折射率与波长成负相关。 衍射光栅 在石英或玻璃的表面刻划许多平行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 白光 红 紫 λ1 λ2 800 600 500 400 吸收池 （或称比色杯、比色皿、比色池） 一般由玻璃或石英制成 注意：a. 与光束垂直；b. 规格相同；c. 清洁 5. 检测器 光→电，并逐级放大 6. 测量装置 电流表、记录器和数字示值读数单元 吸光度与浓度的关系 A = ?bc 吸光度 光源 检测器 吸光度 光源 检测器 b 吸光度 光源 检测器 b 0.00 0.22 0.42 确定空白对照，调试紫外分光光度计 “调0，调100” 以待测样品的“溶剂”作为空白对照，在波长260nm处调节紫外分光光度计读数至“0” 确定稀释倍数： 取待测的DNA溶液，加入比色杯，读取260nm 的吸收值 若度数不在0-1之间，则需进行相应比例的稀释（用蒸馏水或TE），并记录稀释倍数 实验操作（调试分光光度计，确定DNA样品的稀释倍数） 确定待测DNA的260nm 的吸收值。 260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度： OD260值为1相当于约50?g /ml双链DNA 公式： dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数  （单位为?g /ml） 测定280nm的吸收值。 按相同方法测定280nm的吸收值 可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。 实验操作（获得吸光度度数并计算DNA浓度）　 第一步，先把天然胰岛素拆成A、B两条链， 再把它们重新合成为胰岛素； 第二步，用人工合成的Ｂ链同天然的A链相连接； 第三步，把人工合成的Ａ链与人工合成的B链相结合。 前排右起：陆德培、邢其毅、施溥涛， 后排右起：季爱雪、李崇熙、叶蕴华、汤卡罗 电泳：重组质粒的酶切鉴定 紫外分光光度法检测DNA含量 实验五 质粒DNA电泳的上样安排： 组内各人的酶切后的质粒和未切的质粒相邻上样 9μl 酶切产物+3μl loading buffer 8-9μl 质粒+3μl loading buffer 基因工程诞生的技术突破 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶 来源：原核生物 功能：自我保护——细菌的限制和修饰系统（R/M体系） pUC119图谱 重组质粒 BamH I Hind III 双酶切 电泳检测 5-G G A T C C-3‘ 3-C C T A G G-5 BamH I 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III 电泳结果： M：Marker 1：酶切样品1 2：酶切样品2 3：酶切样品3 4：未酶切质粒 M 3 2 1 1Kb 200bp 100bp 2Kb 5Kb 600bp 400bp 4 酶切结果 紫外分光光度法检测DNA 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。 分光光度技术 752型分光光度计 特点 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L, 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ （1～2％） 操作简便快速 应用广泛 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。 光学光谱区 远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外 （真空紫外） 10nm~200nm 200nm ~380nm 380nm ~ 780nm 780 nm