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电泳基本原理及相关知识 DNA琼脂糖凝胶电泳 ? 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 ? 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类） ? 纸电泳 ? 醋酸纤维膜电泳 ? 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? 电泳的基本原理 利用物质的两个差异来分离物质 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状 ? 电泳的影响因素 ? 带电粒子的性质 ? 电场强度 ? 溶液的pH ? 溶液的离子强度 ? 电渗现象 ? 环境因素 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动 因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光 EB的替代染料：SYBR GREEN，GOLDVIEW DNA琼脂糖基本原理 点样孔 细菌基因组DNA OC 型质粒DNA LC型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 实验结果的分析 实验三琼脂糖电泳检测HVB PCR结果银染技术检测apoB基因多态性 HBV-PCR产物 实验评价与总结 制备琼脂糖凝胶 (1.5%) PCR产物电泳 apoB基因PCR产物 制备琼脂糖凝胶 (1.5%，已加DNA染料) PCR产物电泳 EB染色 电泳 染色 制胶 观察结果 本次实验课时间安排 15-20 min 40-50mA，2小时 15-20 min 30 min 15-20min 2个组 1-2个组 HBV-PCR电泳胶上样： PCR apoB电泳胶上样： 正对照 负对照 待测样品1 待测样品2 待测样品3 待测样品4 正对照 负对照 待测样品1 待测样品2 待测样品3 待测样品4 正对照 负对照 待测样品1 待测样品2 待测样品3 待测样品4 第一大组 第二大组 第三大组 每块胶5-7个样品 8-10个样品 HBV PCR检测结果（示例） PCR检测人 ApoB 基因多态性 实验操作及注意事项 独立位于2号染色体短臂末端（2p23），单拷贝。基因全长43kb，含28个内含子和29个外显子。 功能：载脂蛋白 ApoB基因具有明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸变异的有54处。 3’ 端高变区的数目可变的串联重复顺序（VNTR），信号肽（SP）多态性。ApoB基因DNA 3 ’ 端181bp构成一种由11-16bp重复排列的富含A-T的超变异小卫星序列，分布于500-800bp之间。 ApoB基因 在此区域两端设计引物，可检测其多态性 利用ApoB基因多态性进行遗传多样性分析 Faisal Khan, Suhasini Bhatnagar and Suraksha Agrawal, Genetic variation of ApoB 3’ hyper variable region polymorphism among Brahmins of North India, CURRENT SCIENCE, VOL. 86, NO. 5, 10 MARCH 2004 5% PAGE ApoB的多态性与疾病 ApoB是富含胆固醇和甘油三酯脂蛋白的重要组成成分，对脂质在人体转运、代谢、维持体内脂质水平的恒定起重要作用。大量临床资料及流行病学调查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白（LDL）水平与动脉粥样硬化呈正相关，是其主要危险因素之一。 ApoB的基因多态性与动脉粥样硬化有不同程度的关系。 ApoB的LDL受体结合区附近发生突变，将影响血中胆固醇浓度升高，最终促使冠心病和肥胖。 ApoB基因的微小变异可引起个体出现高胆固醇和高甘油三酯血症。 基因诊断 定义：应用分子生物学技术,在DNA或RNA水平，通过检测致病基因（内源或外源）的存在、基因结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。 常用方法：核酸杂交；PCR；限制性内切酶 基因结构的异常可在DNA水平直接检出。 对于致病基因尚未明确，或虽已