G418筛选稳定标准表格达细胞系经验总结计划.docxVIP

G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从 G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其 他战友遇到的情况 , 和大家分享 . 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定 G418浓度： 1、由于每种细胞对 G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的 G418 有效成分的比重不同，一般 1g 的粉剂中有效的 G418含量大约为 0.722g 。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细 胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而 G418对细菌和真核细胞都起作用。 neo 就是编码 3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素 G418。在进行转染时细胞膜受到 影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上 G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染 时不加其它抗生素。 3、汇合度对 G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过 50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前， 一定要确定 G418的最佳筛选浓度。具体如 下：将细胞稀释到 1000 个细胞 /ml ，在 100ug/ml~1mg/ml 的 G418浓度范围内进行筛选， 选择出在 10~14 天内使细胞全部死亡的最低 G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个 具体试验： 3x106 个细胞电转后，分别接种 1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到 24 孔板中， 48h 后加药筛选，此时 1/300 细胞孔内大约 50%汇合度。理论上 1/4000 孔内应有 4%的汇合度。筛选 9 天后，观察 1/4000 孔内有两三个克隆，按比例 1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但 是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被 没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染 24 小时 之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢 G418的浓度和活性都会下降，所以每 3~5 天 都要更换一次含有 G418的筛选液。这时药物浓度可以降至 200ug/ml 。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一 般是转染 48 小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的 1/2 。 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液 加药筛选约 6 天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1， 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有 neo 表达的阳性细胞死亡，即非选 择性死亡，因此要及时换液 ，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚 至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染 3T3 细胞，在 3T3 细胞汇合度达到 80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按 1：1 混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。 3，适当增加血清浓度。 筛选时出现的问题及其解决办法： 1， 问题 1。做 hela 细胞的筛选，现在已经筛选 3 周，在 6 孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到 96 孔板中，就用 2ul 胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近） ，就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？ a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用 37 度温箱预热，并且 PBS润洗细胞层，以减 少可能残存的血清的影响； b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到 37 度温箱中 继续作用 1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散； c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可 隆了呀 d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤 2 中显微镜下见细胞尚未完全松散 开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。 我的建议： 1、在 100mm dish 中挑克隆，细胞分的稀一点。 2、把细胞全部消化下来， 在 96 孔板中逐步稀释获得单克隆 2， 2。 成功的概率：只要有抗性加 ，挑 到的机率 是比 大的。一般 能挑到 定表达的概率我 大概有 70－80％，但是想挑到表达量高且能 定表达的， 不大容易。 个可能是在染色体上，合适的