1 荧光定量PCR的原理及应用.ppt

R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） 优点： 对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势 设计简单，准确性好 缺点： 只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高 双标记探针（Taqman Probe） 荧光定量PCR实验技术路线 查询目的基因序列 选择合适的荧光标记方法 选染料法则购买SyBr Green I或相应试剂盒；探针法则设计并合成荧光探针 设计特异引物或探针 引物设计的一般原则： 产物长度在80-300bp之间 产物GC含量在50-60%之间 引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间 应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或C Primer 5.0 /Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True 荧光定量PCR实验技术路线 实验时先对普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在条带特异的情况下才能采用染料法进行荧光定量PCR实验 注意 模板浓度：在普通PCR基础上可以稀释10~100倍 引物浓度：0.4~ 0.9 μM （一般略低于PCR引物量） 荧光物质浓度：按说明书操作，根据实验结果优化 加样准确性：避免微小加样 荧光定量PCR实验技术路线 模板 Plasmid DNA 目的片段在Plasmid DNA 中很易被扩增，可以适当稀释 Total DNA 目的片段在Total DNA中丰度相对较低，因此Total DNA量要略高于Plasmid DNA　 cDNA 以cDNA为模板时一般将反转录产物原液稀释10~50倍后作模板 荧光定量PCR实验技术路线 荧光定量PCR反应灵敏，微小差异都能被反映，实验中要避免核酸污染，尤其是避免PCR产物污染。 试剂反复冻融对实验也有影响，各组分采用少量分装保存 低浓度模板反复冻融容易降解，少量分装保存 定量方法 绝对定量 相对定量 标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的浓度 log N0 =- Ct logE +logN 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较 绝对定量 标准品：含有目的片段的浓度已知的核酸 绘制标准曲线时，一般选取4-5个点（多于5个更好），被选点的模板浓度范围要包括待测样本浓度 相对定量——在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化 只需要了解相对于参照样本目的基因的表达量的变化量，而不需要确切的知道基因的表达量具体是多少，采用相对定量即可。 比较的依据是实验时不同样本的总核酸模板一致 用表达量基本恒定的看家基因作为内参照来体现上样模板的量 相对定量方法 比较CT法（ △△CT ） 前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致 双标准曲线法 利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量 样本目的基因表达量= 目的基因标准曲线测得值 持家基因标准曲线测得值 目标基因与持家基因扩增效率差别举例 对于每一个稀释梯度，都用 GAPDH 和 c-myc 引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以及△CT值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对△CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0 ，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△ C T 方法进行相对定量。 Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen,METHODS 25, 402–408 (2001) 相对定量方法二——双标准曲线法 当两个扩增反应效率不同或者不方便证明的时候，则需要通过双标准曲线的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。 对于所用的标准品只要知道其稀释比例即可。 最终结果必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。 在反应中同时扩增一内源控制物，如持家基因等以标准化起始模板的量 谢 谢 ! * Taqman技术原理是，利用Taq酶的5′外切酶活性，即天然的5′→ 3′核酸外切酶活性，裂解双链DNA 5′端的核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有叉样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5′端标记一个荧光分子，3′端标记另一个荧光分子