(完整版)细胞一氧化氮检测.docVIP

NO Assay (BioAssay Systems--QuantiChromTM Nitric Oxide Assay Kit ) - 原理 : NO 能被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐， 从而通过测定亚硝酸根离子 NO2 /硝酸根离子 NO3-的总量来确定 NO 水平。 样品制备： 1.用 1mL 枪头吸弃每孔上层细胞培养基 1mL ，先横刮 3 次再竖刮 3 次，刮起剩 下 1mL 细胞培养液，然后用 1mL 枪头冲吹细胞 3 次，显微镜下计数细胞数，收集 1×106 细胞于 1.5mL 离心管中，置于冰上。 2.于 40C，5000rpm 离心 3min，吸弃上清液，收集细胞沉淀。 3.向细胞沉淀中加入 1mL 冰上预冷的 1×PBS 液，用 200uL 枪头混匀后于 40C， 5000rpm 离心 3min。吸弃上清液，收集细胞沉淀，置于冰上。 4.向细胞沉淀中加入 150uL 细胞裂解液 ，用 200uL 枪头混匀后于冰上裂解 30min。 5.于 40C，12000rpm 离心 10min。 6.向 150uL 细胞裂解液中加入 8uL ZnSO4， vortex 上混匀，然后加入 8uLNaOH， vortex 上混匀，于 40C，14000rpm 离心 10min。取上清液，按 50uL/管分装，作为 NO 检测样品。 标准曲线制作： 稀释标准品：取 25uL 1.0mM 标准品，加入 225uL ddH2O，用 200uL 枪头混匀，将标准品稀释成 100uM Premix。 按下表制作标准曲线： No. Premix+ddH2O Nitrite(uM) 1 0uL+100uL 0 2 20uL+80uL 20 3 40uL+60uL 40 4 60uL+40uL 60 5 80uL+20uL 80 样品 NO 水平测定： 1.WR 工作液配制：将 25uL Reagent A，25uL Reagent B和 50uL Reagent C于 1.5mL 离心管中充分混匀。 2.样品及标准品反应：将 50uL 样品和标准品与 100uL WR 工作液于 1.5mL 离心管中混匀，于 600C 孵育 10min。 3.测定：将反应好的样品与标准品加到 96 孔板中，于 500-570nm(峰值 540nm) 测定 OD 值。 4.NO 浓度计算：（按如下公式计算） NO】 =(OD sample-ODblank)/slope (uM)， 注：ODblank 为空白对照吸光值， slope 为标准曲线斜率。其中 1uM Nitrite=30pg/mL NO