实验—血球计数板的使用.docxVIP

、血球计数板的使用原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面 积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数 的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。 血球计数板是一种专门用于计算较大 单细胞微生物 的一种仪器，由一块比普 通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽， 构成三个平台。 中间的平 台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半， 每半边上面刻有一个方格网。 方格网上 刻有 9 个大方格， 其中只有中间的一个大方格为计数室。 这一大方格的长和宽各 为 1mm ，深度为 0.1mm ，其容积为 0.1mm 3 ，即 1mm× 1mm× 0.1mm 方格的计 数板；大方格的长和宽各 2mm ，深度为 0.1mm ，其容积为 0.4mm 3，即 2mm× 2mm× 0.1mm 方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字， 其含义是：XB-K-25 为计数板的型号和规格， 表示此计数板分 25 个中格；0.1mm 为盖上盖玻片后计数室的高； 1/400mm 2表示计数室面积是 1mm 2，分 400 个小 格，每小格面积是 1/400 mm 计数室通常也有两种规格： 一种是 16×25 型，即大方格内分为 16 中格，每 一中格又分为 25 小格；另一种是 25×16 型，即大方格内分为 25 中格，每一中 格又分为 16 小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点， 即每一大方格都是由 16×25=25× 16=400 个小方格组成。 1 ．16×25 型的计数板 将计数室放大，可见它含 16 中格，一般取四角： 1、4、13、16 四个中方格（ 100 个小方格）计数。将每一中格放大，可见 25 个 小格。计数重复 3 次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算： 酵母细胞个数／ 1mL=100 个小方格细胞总数 / 100 × 400× 10000× 稀 释倍数 2 ．25×16 型的计数板 中央大方格以双线等分成 25 个中方格，每个中方 格又分成 16 个小方格，供细胞计数用。一般计数四个角和中央的五个中方格 （80 个小方格）的细胞数。计数重复 3 次，取其平均值。计数完毕后，依公式计算： 酵母细胞个数／ 1mL ＝80 个小方格细胞总数 / 80 ×400× 10000× 稀释 倍数 二、血球计数板的使用方法步骤 使用血球计数板计数时，按照如下的实验步骤进行： 1．镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则 需清洗，吹干后才能进行计数； 2．加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸 管吸取稀释后的酵母菌悬液， 滴于盖玻片边缘， 让培养液自行缓缓渗入， 一次性 充满计数室，防止产生气泡， 充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之 间的矩形边缘为宜；多余培养液可用滤纸吸去。 3．计数。稍待片刻（约 5min ），待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后， 将计数板放在载物台的中央， 先在低倍镜下找到计数室所在位置后， 再转换高倍 镜观察、计数并记录。 调节显微镜光线的强弱适当， 对于用反光镜采光的显微镜 还要注意光线不要偏向一边， 否则视野中不易看清楚计数室方格线， 或只见竖线 或只见横线。 在计数前若发现菌液太浓或太稀， 需重新调节稀释度后再计数。 一般样品稀 释度要求每小格内约有 5~10个菌体为宜。每个计数室选 5个中格（可选 4个角和 中央的一个中格 ）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线 上的。 如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。  三、血球计数板的使用注意事项 1．从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵 母菌分布均匀， 防止酵母凝聚沉淀， 提高计数的代表性和准确性， 求得的培养液 中的酵母菌数量误差小。 2．如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便 于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取 1mL 酵母菌培养液，加入成倍的 无菌水稀释，稀释 n 倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每 小方格内含有 4—5 个酵母细胞为宜。 特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。 3．活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌 体计数，若芽体小于母细胞一半时为 1 个酵母细胞。 4．对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般 可采取“数上线不数下线， 数左线不数右线 ”的原则处理，另两边不计数。计数时， 如果使用 16 格×25 格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右 下 4 个中格 （即