免疫组织化学与组织学相关技术课件（研究生）实验二 链霉亲和素－过氧化物酶法(2).pptVIP

* * * 研究生学位课程 《免疫组化及相关组织学技术》 实验二 链霉亲和素-过氧化物酶法 (SP法) 一、实验目的和要求 实验目的 1. 掌握免疫组化染色的原理及步骤 2. 了解免疫组化实验的设计及问题解决方法 利用抗原（antigen, Ag），抗体（antibody）特异 结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。 免疫组织化学基本原理 二、SP法基本原理 （Streptavidin-Perosidase） 链霉亲和素-过氧化物酶连结法： 抗原 ＋ 一抗 ＋ 生物素标记的二抗 ＋ HRP标记的链霉亲和素(SP复合物) ＋ DAB，显色 棕色沉淀 HRP标记的 链霉亲和素 生物素偶联的 二抗 一抗 抗原 三、SP法优点 可检测酶、多肽、蛋白质、蛋白多糖、激素等多种物质。 与ABC、SABC法相比，SP复合物小，渗透能力强，反应速度快，灵敏 三步法，同一试剂盒（含二抗、SP、底物）可检测多种抗原 原位显示，可对检测物质初步定位 可半定量：淡黄－棕黄－深棕色，阳性细胞数。 四、SP染色法注意事项 载玻片的处理（多聚赖氨酸等粘附剂） 选择对照(阳性对照、阴性对照、空白对照、自身对照）消除假阳性、假阴性 染色过程不能干片 抗体和试剂的选择 一抗最佳浓度的确定：预实验，浓度梯度 抗原修复（酶/热修复等，根据试剂说明书） 显色时间的控制：2-5min，镜下观察控制 免疫组化结果的判断（部位，-，+，++，+++） 抗体和试剂的选择和处理 一抗特异性：物种（鼠抗人） 单克隆抗体 二抗特异性：先用二抗动物 来源正常血清封闭 （羊抗鼠二抗，羊血清封闭） “三抗”特异性：卵白素－生物素阻断组织中的内源性生物素，如肾、肝等。 DAB底物反应的特异性：H2O2处理，阻断组织中的内源性过氧化物酶。 A. DDX27——表达于细胞核； B、IP3R3——表达于胞浆 可检测物质在细胞中的分布情况。 SP法结果: A. p53在消化道腺癌中的表达 B. p53在正常癌旁组织中的表达 可检测物质在不同组织中的表达情况。 SP法结果: * * *