2-5 微生物学第二模块实验五 产淀粉酶菌的诱变育种.pptVIP

* 实验四 产淀粉酶细菌的鉴定（续） 电泳结果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 利用NCBI数据库鉴定菌种 / Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢杆菌 实验结果与分析 利用NCBI数据库对测序结果进行BLAST，分析筛选的微生物属于什么种属。 进化树 实验结果与分析 根据上述进化树，分析本班级分离到的产淀粉酶细菌的种属特征有什么规律 实验五 淀粉酶产生菌的  紫外诱变育种 第二模块 产淀粉酶微生物的筛选和选育 观察紫外线对产生淀粉酶细菌的诱变效应； 学习并掌握紫外线诱变育种的方法； 熟悉有关微生物突变体的筛选方法以及筛选培养基的设计思路。 实验目的 实验原理 （一）诱变 诱变（mutagenesis）是指用物理、化学或生物因素诱导生物体的遗传特性发生变异的方法。 对微生物而言，采用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株，供生产或科研用。 （二）常用的各类诱变剂 物理诱变剂 紫外线、快中子、x射线、β射线、γ射线、激光、离子束 化学诱变剂 碱基类似物 2－氨基嘌呤、5－溴尿嘧啶、8－氮鸟嘌呤 与碱基反应的物质 硫酸二乙酯、甲基硫酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝基乙基脲、亚硝酸、氮芥、四硝基喹啉、乙烯亚胺、羟胺等 在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基 吖啶类染料 生物诱变剂 噬菌体、转座子 （三）紫外线诱变机理 DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。 其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。 （三）紫外线诱变机理 紫外线具有致死和诱变的双重效应，现代育种理论认为，当诱变的微生物致死率在75%-80%时，产量性状正突变率较高。因此需要测定微生物经紫外线照射后的致死率，确定最佳的照射时间。 紫外线虽然对生物体构成杀伤力，但是穿透能力很弱，不能穿透玻璃、衣物和纸张等。 （四）光修复现象 经紫外线损伤的DNA，能被可见光修复！ 因此为了避免细菌光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应该在红光下进行，并且将照射处理后的微生物置于暗处培养。 实验器材 1.菌种 诱变出发菌株：自土壤分离的淀粉酶产生菌菌株 2.培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基 3.主要试剂 无菌水、碘液 4.主要器皿 紫外交联仪、离心管、移液器、离心机、玻璃涂布棒等 实验步骤 （一）实验准备 各组挑选一株产淀粉酶的细菌，用无菌的接种环，从菌种斜面保存管挑取少量菌落，接种到试管液体培养基。每组接种一支。 置于30℃、220rpm的摇床上培养8小时。 （二）平板制作 融化淀粉培养基，每组倒6块平板，在平板上做好标识。 处理 + 10-6 处理 + 10-7 处理 + 10-8 未处理 + 10-6 未处理 + 10-7 未处理 + 10-8 （三）细菌悬液制备 取液体培养物（培养了8h）0.5mL于dorf管中，每组2管，8000rpm，离心5min，弃上清； 每管菌体用1mL无菌水洗涤一次， 8000rpm，离心5min，弃上清； 每管再各加1mL无菌水制成菌悬液。 （四）稀释涂布 稀释菌液：将菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释（在dorf管中进行），得到； 涂布平板：分别取10-6、10-7、10-8三个浓度的菌悬液0.1ml涂布平板，每个稀释度涂布2块平板。注意无菌操作、涂布均匀，静置5min。 （五）紫外诱变 以下操作需在避光条件下进行 将紫外交联仪打开预热20分钟； 将10-6、10-7、10-8平板置于紫外诱变箱中，打开皿盖，照射200×102μJ/cm2（单号排）或者100×102μJ/cm2 （双号排），然后迅速盖上皿盖； 将上述平板和未处理的平板置于筐中，30℃避光倒置培养24小时。 （六）试管转接 将试管斜面进行二次转接。转接方法如下图所示。 （七）观察、分析结果 （七）观察、分析结果 观察诱变效应： 分别对处理和未处理的10-6、10-7、10-8平板上铺碘液，测量淀粉水解圈直径与菌落直径并计算其比值（H/C比值），比较处理和未处理组的数值