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实验基本步骤 提取细胞蛋白 BCA定量 制备蛋白胶（SDS交） 蛋白样品变性 电泳 转膜 封闭 一抗 TBST洗涤 二抗 TBST洗涤 显影 结果分析 试剂配制 PBS磷酸盐缓冲溶液1L 磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g 加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌 PBST （ PBS+0.05% 吐温-20） 500mlPBS+0.25ml 吐温-20 电转液500ml Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解 加入100ml甲醇，置于4 C冰箱预冷 电泳液（1X） 10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水 TBS TBST （TBS+0.05% 吐温-20） 50mlTBS+450ml 纯水 +0.25ml 吐温-20 封闭液 TBST1X+5% 奶粉 40ml封闭液=40mlTBST+2g 奶粉，40 C预热 WB实验 —、蛋白样品制备 准备:一管细胞，PBS( 4C预冷)，PMSF (100mM )，移液枪(1000ul, 10ul), 1.5mlEP管2个，高速冷冻 离心机4 C预冷 1?于-20 C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液 2?加入1ml 4 C预冷的PBS( 0.01M pH7.2?7.3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后 4C, 8000r离心5min，然后 弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。 按1ml裂解液加10卩l PMSF( 100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。 ) 在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回 摇动。 裂解完后，于 4 C下12000 rpm离心5 min。 7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 ml的离心管中放于一20C保存。 蛋白含量的测定BCA 蛋白含量的测定 BCA定量） 准备：96 孔板，移液枪（1000ul, 10ul, 200ul）, BCA工作液（A+B）, 50mlEP管，IxPBS BSA标准液 1?将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用） 2?算好孔数（总的）每孔加200UIBCA工作液（A+B），（ A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul， B 液 240ul） 3?将样品稀释到一定倍数才能定量，（ 10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18UIPBS即稀 释10倍），做三个重复则需要 60ul，一般配80ul 4?配蛋白标准样品，将 2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至 0.5mg/ml，若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则 需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和 150ul PBS溶液 5?将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按 0, 1,2,4,8,12,16,20』加到标号的区域，之后 在加标准样品的孔内，将孔内溶液用 PBS补足到20ul 6?每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差 7?将加好的96孔板放在37 C下孵育30分钟 8?孵育完后，放在酶标仪轻微震荡 3-10S，中速，吸光值595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后 以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。（ R2 0.98才有用，酶标仪操作：两个箭头图标,1是 结果,2是保存） 9?计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了 10倍） 蛋白质定量标准曲线加样量 骨口. 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白量/ul 0 1 2 4 8 12 16 20 (0.5mg/ml ) 背景液（PBS /ul 20 19 18 16 12 8 4 0 标准液浓度 mg/ml 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 三、SD4 PAGE电泳 配胶（12%,可以提前配好） 准备：玻璃板，梳子， AP （解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（ 4 C冰箱冷藏） （1）玻璃板验漏 5mi n （2 ）按表配置分离胶 （3） 灌胶，加酒精封压，凝 30min （注意不要有气泡） （4） 按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝 30mi n （5） 取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中 4C冰箱保存备用 样品处理 准备：PBS移液枪，1.5mlEP管 （1） 稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至1mg/ml （注意loadingbuffer的加入也得算入） （2） 取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中，加入6 X SDS上样缓