生物技术制药：6 酶工程制药-2.pptVIP

第五节 酶工程的研究现状 一、生物酶工程 是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括： 1、用基因工程技术大量生产酶 。 2、对酶进行修饰，产生遗传修饰酶。 3、设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶 。 化学酶工程 1、天然酶 2、化学修饰酶 （1）化学修饰酶的功能基。 （2）交联反应。 （3）大分子修饰作用。 3、固定化酶 4、人工模拟酶 二、突变酶 1.突变酶概念 定点突变( site-directed mutagenesis,SDM) 随机突变 (random and extensive mutagenesis,REM) 突变酶：主要采用定点突变的技术产生符合人类设计的”突变型”蛋白 2.定点突变的方法 （1）引物介导的定点突变 (2)PCR介导的定点突变 （3）盒式突变 利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。 3.突变酶的应用 （1）提高酶活性及稳定性 对活性中心的氨基酸逐个进行突变，找出关键氨基酸进行，得出可信结论 （2）研究酶的功能基团 对靶目标进行突变 1.同源序列比较，找出保守区域 2.化学修饰 3.空间结构信息基础上，进行定点突变 三、酶的分子进化 （3）非同源改组 渐进切割杂合酶技术(incremental truncation for the creation of hybrid enzyme, ITCHY) 核酸外切酶对两个亲本进行切割，产生一系列相差单碱基的基因片段，再将两组片段化基因互相连接，产生杂合基因文库 （4）结构域改组 外显子改组(exon shuffling）类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关 底物显色反应 其他的筛选方法, 如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等 高通量筛选：固相筛选，ELISA，萤光筛选等 定向进化将筛选技术放首位 四、抗体酶 1.抗体酶（Abzyme) 或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。 要使抗体成为具有催化功能的抗体酶，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，就可能成为抗体酶。 3.抗体酶的制备方法 （1）诱导法 用设计好的半抗原(过渡态类似物）通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。 （2）基因工程法 对单抗中抗体酶结合部位突变进行定点突变。 五、人工模拟酶 模拟酶:根据酶的作用原理，人为制造的具有酶性质的催化剂。 利用有机化学合成的方法合成了一些比酶结构简单得多的具有催化功能的蛋白或非蛋白质分子。 特点：高效，高适应性，结构简单。 作用机制：稳定过渡态理论,酶先与底物结合,进而选择性稳定某一特定反应的过渡态,降低反应活化能,从而加快反应速度. 环糊精是一种优良的模拟酶 环糊精外侧亲水,内侧疏水,形成空穴,可以从水溶液中抽提适当形状的有机小分子,并束缚入空穴 通过对环糊精修饰,可使空穴适合不同的底物 环糊精催化反应时,先结合再反应. 环糊精模拟的胰凝乳蛋白酶与天然酶催化效率几乎相同 胰凝乳蛋白酶活性部位由Ser195, His57, Asp102组成，模拟酶在催化侧链上接上羟基，咪唑基，羧基，发挥催化作用 环糊精束缚底物，活性基团发挥催化作用，环糊精的稳定性强于蛋白质成分的天然酶 人工合成的冠醚,穴醚,环芳烃也用来构建酶模型 胶束模拟酶 胶束在水溶液中提供疏水微环境,可对底物束缚 将催化基团如咪唑,巯基,羟基和辅酶共价或非共价连接或吸附在胶束上,可提供“活性部位” 分子印迹酶 生物印迹酶 以天然的生物材料如蛋白质和糖类为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。 已成功模拟酯水解酶等 六、酶的化学修饰 酶的化学修饰：提高酶的稳定性,解除酶的抗原性,改变酶学性质,扩大酶的应用范围 ⒈酶的化学修饰概念 通过主链切割,剪切和侧链的化学修饰对酶蛋白进行分子改造. 温和条件下，可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而使单个氨基酸或功能基团发生共价的化学改变 2.酶的化学修饰方法 1.酶的表面化学修饰 (1)大分子修饰 可溶性大分子，如PEG、右旋糖苷、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 用PEG修饰SOD，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核