生物化学与分子生物学：第一章 蛋白质的结构与功能.pptVIP

第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein 蛋白质的分离和纯化方法： （一）透析和超过滤 （二）有机溶剂沉淀、盐析 （三）电泳 （四）层析 （五）超速离心 （一）透析（dialysis）和超滤 蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。 利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。 超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。 （二）盐析和有机溶剂沉淀 原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。 盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到 蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水 溶液中的稳定因素，而使之从溶 液中沉淀析出的现象。 有机溶剂沉淀： 常用试剂：丙酮、乙醇 缺点：温度较高时，易致蛋白质变性。 必须在低温下操作，并尽快将有 机溶剂分离。 （三）电泳（electrophoresis） 蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。 由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。 ＋ － ＋ － 电场 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 几种重要的蛋白质电泳: （四）层析（chromatography） 吸附层析 离子交换层析 分子筛层析(凝胶过滤) 亲和层析 依理化性状不同，将蛋白质分离。 目 录 目 录 (五)离心 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 （六）应用化学或反向遗传学方法可分析 多肽链的氨基酸序列 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。 从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构： 1.下列哪种氨基酸是碱性氨基酸？A. 丙氨酸 B. 亮氨酸 C. 赖氨酸 D. 色氨酸E. 甘氨酸2. 组成蛋白质的基本单位是：A. L-β-氨基酸 B. L-α-氨基酸 C. D-α-氨基酸 D. D-β-氨基酸E. D- γ氨基酸3. 维持蛋白质分子一级结构的化学键主要是：A. 二硫键 B. 盐键 C. 氢键 D. 肽键E. 疏水键4. 蛋白质分子中α-螺旋结构属于蛋白质：A. 一级结构 B. 二级结构C. 三级结构 D. 四级结构E. 模体结构