第三章分子克隆的载体.ppt

第三章 分子克隆的载体;载体的定义;载体的功能;载体的特征;基因克隆;基因文库gene library;功能 克隆载体:克隆一个基因或DNA片段 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体组中;来源： 质粒载体plasmid 噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid 真核细胞克隆载体;载体的种类和特征;第一节 质粒（plasmid）载体;质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）; 一、质粒的基本特征;克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、 储存和表达。;质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（（open circular DNA, ocDNA） L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA）;L;2.质粒的基本特征;2）质粒的不相容性plasmids incompatibility;A;3）质粒的可转移性transferring;值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定;4）携带特殊的遗传标记;标记基因marker gene;氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）;琥珀突变抑制基因 supF 在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。;正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。;筛选标记基因;α-互补是指 lacZ 基因上缺失近??纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。 ;lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码 β-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。 乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。 IPTG：异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷，乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物； X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。 X-gal 可作生色剂，被 β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。;乳糖操纵子(lac operon)的结构;功能互补;;插入失活;; 二、质粒载体的种类;转化效率与质粒大小成反比，质粒＞15kb，转化效率成为限制因素;2. pBR322之后 调整载体的结构，提高载体的工作效率 pBR322 pUC系列质粒 去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记 增加辅助功能，表达载体（expression vector），穿梭载体（shuttle vector）;3.克隆载体;;2）pUC18/19质粒载体;;3）pUC118/119质粒载体;4）pGEM-3Z/4Z质粒载体;;5）多功能质粒载体;;4.表达载体expression vector;;第二节 λ噬菌体载体 λ phage vectors;头部;一、λ噬菌体的分子生物学;当 ??噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板 此时，???噬菌体可选择进