第十六章色谱分离法.ppt

3）聚丙烯酰胺（Bio-Gel P) 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。该凝胶多制成干性珠状颗粒剂型，使用前必须溶胀。聚丙烯酰胺凝胶层析对蛋白质相对分子质量的测定、核苷及核苷酸的分离纯化，均能获得理想的结果。 16.3.7.3凝胶 16.3.7.4使用过程方法及注意事项 1)、凝胶的选择 一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围选择合适型号的凝胶。例如蛋白脱盐常采取分离范围较小的Sephadex G-10或G-15。 选择凝胶的另一个方面就是凝胶的颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。 2)、凝胶的处理 凝胶使用前要首先要进行处理。 1）估计用量 选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量： 干胶用量(g)＝柱床体积(ml)/凝胶的床体积(ml/g) 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10％～20％(质量分数)。 不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短，在20℃条件下需3～4 h；但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1～5 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。 琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。 3)、水中膨化 膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。 4)、排除凝胶中气泡 4）凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂通常加入0.02％(质量分数)的叠氮化钠，4℃下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50％(体积分数)的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95％(体积分数)乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60℃烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。 5) 凝胶层析的基本操作 （1）层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100 cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。 （2）装柱（凝胶层析柱） a.除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。 b.应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。 c.将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 d.先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要捧除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。 5) 凝胶层析的基本操作 e.柱顼接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注人柱内。注意避免产生气泡。 f.柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。 5) 凝胶层析的基本操作 g.柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。 h.调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规数值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到的流速，一般要低于后者10。 5) 凝胶层析的基本操作 i. 检查柱装得是否均匀和V0的测定：用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析，则既检查了装柱质量也测定了V0。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空体积(V0)。蓝色葡聚糖2000是平均分