分子克隆及细胞培养基本实验方法.docx

分子克隆及细胞培养基本实验方法 载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存一20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20C或-70 C备用。（甘油菌中甘 油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含 100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌 种）,37 C培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含 100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37C振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中， 37 T振荡过夜（约 12~16小时）。 1.3 小规模制备质粒 DNA （QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，1分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组 DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒 4~6次轻混；离心 10分，13 000rpm ⑸上清入 QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心 30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心 1分 ⑻换新管，加入 50ul EB，静置1分（EB 37 C预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig (ul) pAdTrack-CMV (ul) 17173 17 17 3 3 5 1 1 TOC \o 1-5 \h \z 10X NEbuff 2 3 10X BSA 3 底物DNA 5 内切酶 Hi nd川 1 Xba I 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37C水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至 12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul电泳观察酶解是否完全 ⑷65 C灭活内切酶 ⑸-20 C保存备用 1.5 回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol ) ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG (300ul QG /100mg胶)；＞2%的胶，应加大 QG用量(600ul QG /100mg )； ⑶水浴50 C, 10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与 buff QG相似； ⑷当DNA片段在＜500bp或＞4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸ 结合：将混合物转入 QIAquick柱，离心13000rpm，1min ；(柱容量 800ul/次)； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min ； ( DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入 PE后静置2-5min )；弃离心液，再离心 13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的 1.5ml Ep管，加入 30~50ul buff EB 或 出0 (滴 于 QIAquick 膜上！)，静置 1min，离心 15000rpm， 1min ； ⑻-20 C保存备用。 1.6连接反应 反应组份 数量（ul） TOC \o 1-5 \h \z dd.H20 8 T4 10X buff 2 载体DNA（ ul） 1 目的片段（ul） 8 T4DNA连接酶 1 Total : 20 ul ⑵16C水浴12-16小时（过夜） ⑶直接用于转化或-20 C保存备用 1.7感受态细胞的制备 ⑴ 菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加 Amp）, 37C振摇4-6 hr，至中对数 期； ⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4 C, 4 000-6 000rpm ）收菌； ⑶弃上清，将菌体悬浮于 800ul 0.1M CaCb （冰预冷）中，冰浴 10min，离心 （4C，4000-6000rpm ）; ⑷ 再将菌体悬浮于 200ul 0.1M CaCb （冰预冷）中，冰浴， 12-24hr可用。菌体 沉淀时，重悬操作要轻。 1.8转化 ⑴新鲜感受态细胞 200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min ; ⑵42C热休克90sec,勿摇动试管，再冰浴 2min ； ⑶加入液体LB培养基（无抗生素） 800ul，37 C温和振摇45-60min ; ⑷离心 4000-6000rpm，2min，弃去 900ul 上清； ⑸剩余物重悬细菌，铺 Amp