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试剂配制：
HBS：280 mM NaCl, 10mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4, 12 mM Glucose, 50 mM HEPES, 0.5mol/LNaOH, pH调至7.05，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，分装至50ml离心管-20°C保存。
2.5M CaCl2 溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，分装至Ep管-20°C保存。
细胞培养条件：
293-T及Huh7均用含10%FBS的DMEM培养液，HepG2用10%FBS的DMEM培养液培养。HepG2-ATCC培养过程中不铺胶原，种板前铺胶原。
采用四质粒系统phouge ,pMDL,pVSVG ,pREV，
表达载体phouge：pCDH- EF1-MCS-T2A-Puro
磷酸钙转染法转染293-T细胞。
转染35mm板为例
转染前14-16h细胞消化细胞，以汇合度60-70%均匀铺到35mm板中，转染前1h细胞换液，弃掉旧的培养液，换成新鲜无FBS的培养液。加培养液时要小心，293-T细胞贴壁不牢。
制备磷酸钙-DNA沉淀：
配制质粒混合物：phouge 2μg , pMDL 1μg, pVSVG 0.6μg, pREV 0.4μg（质粒体积最好大于0.5ul，如果浓度过高，将质粒稀释）
在1.5ml Ep管中加入90μl超纯水，在水中央加入混好的质粒，将10μlCaCl2 加到底部，沿管壁加入100μl HBS，在HBS与水的分界处用黄枪头吹几个吹散CaCl2，静止20-30min（25min），混匀后均匀滴到细胞中，轻轻摇动，放到37°C培养箱。8-12h后给细胞换成新鲜的完全培养液，加NEAA(100X)20μl(1μl/1ml培养液)。注意要观察细胞状态，细胞状态变差，要及时换新鲜培养液。
准备靶细胞：
1、抗生素最低致死量（需提前做）
加抗生素前14-16h，胰酶消化细胞后，以汇合度为40-60%均匀将细胞铺到24孔板（梯度种板：按照不同的细胞数目种板，取汇合度为40-60%的细胞试抗生素浓度），按照0.5, 1, 2，5.0， 7.5 ， 10.0μg/μl的抗生素的量加到每个孔，72h后观察细胞死亡的情况（期间也要观察细胞情况，每种细胞对抗生素敏感程度不一致，可能需要调整浓度梯度）。确定下最小致死剂量，Huh7的最低致死量为2μg/μl, HepG2-ATCC的最低致死剂量为1μg/μl.
2、收集病毒前14-16h，消化Huh7（50万/孔）及HepG2-ATCC（60万/孔）,以汇合度50-60%均匀铺到35mm培养皿中。
病毒液收集及细胞株筛选：
48-54h收集病毒液，35mm板上清均匀分至2个Ep管，6500g，5min离心，吸取上清（注意不要吸到沉淀）用0.45μm滤膜过滤（可选），均匀滴加至Huh7及HepG2-ATCC中，轻轻摇匀，放置37°C培养箱培养。
1、24h后换新鲜培养液。
2、待细胞汇合度80-90%时将细胞从35mm培养皿消转移至2个6cm培养皿（一叠用于筛选细胞株，一叠用于验证表达情况），培养液补足至5ml，开始加抗生素筛选。
3、待6cm培养皿细胞汇合度80-90%，转移至10cm培养皿，用最低致死量Puromycine培养1周，抗生素剂量减半后，再筛选1周，收细胞冻存至-80°C。（时间从感染开始计算）
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