PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模.docx

PAGE PAGE #/ 3 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其设计互补的 寡核苷酸链做引物，利用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片 段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多 易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的 成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以 避免因末端碱基不配对而导致 PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切 位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引 物量：每条引物的浓度?lumol或10?100pmol，以最低引物量产生所需要的结 果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二 聚体的机会。 2、酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然 酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反应约需酶量（指总 反应体积为 100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量 减少。 3、dNTP dNTP的质量与浓度和PCRT增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保 存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到?，小量分装，-20C冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50?200umol/L,尤 其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其 它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR产物的产量。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 dNTP储存液：dNTP溶于pH为的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到 10mol/L，分装后存放在-20C冰箱中。dNTP使用浓度在20?200卩mol/之间。4 种dNTP?必须等浓度配合以减少错配误差。dNTP使用浓度：在PCF反应中，使用 低dNTP浓度,?可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶 序列的长度和组成来决定最低 dNTP浓度。例如在100卩I?勺反应体系中,4种 dNTP的浓度为20卩moI/L可基本满足合成 卩g DNA或?10pmol/L?的400bp序列。 使用低dNTP浓度侮种dNTP浓度为2卩mol/L）能够高度灵敏地⑺?扩增ras基因 点突变的等位基因。 4、 模板 模板核酸的量与纯化程度，是 PCF成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS勺主要功能是：溶解 细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核 蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与 DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用 乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化 除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCF扩增。RNA模板提取一般采 用异硫氰酸胍或蛋白酶 K法，要防止RNase降解RNA。 5、 Mg2+浓度 Mg2+对PCRT增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCF反应中，各 种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为?L为宜。Mg2+浓度过高，反应特 异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应 产物减少。 弓I物是PCR特异性反应的关键，不好的引物严重影响实验的质量，好的引 物可以事倍功半 ;酶的选择一般是看实验的目的，例如克隆长片段，可能就需要 高保真的聚合酶；dNTP浓度和Mg2+浓度高了会影响PCF反应特异性。DNA模板 中还有蛋白质也会严总影响PCF质量，因此上述5个基本成分质量和浓度必须 合理。