生物制药与药品检验技术 蛋白质类药物分析的“好朋友”—电泳法与蛋白质类药物的“前世今生” 课件：蛋白质类药物的电泳分析.pptxVIP

;项目一 血清蛋白类药物的原料制备与分析检验;蛋白质类药物的电泳分析;学习内容： （1）醋酸纤维素薄膜电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 学习重点： （1）两种电泳分离蛋白质的原理 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作注意事项;一、醋酸纤维素薄膜电泳;用途：在临床检验上，用于血清蛋白、血红蛋白、血清脂蛋白、糖蛋白、同工酶等的分离分析 优点：简单快速、定量方便、比纸电泳分辨力高、分离区带清晰、灵敏度高、便于保存和照相 缺点：分辨能力比聚丙烯酰胺电泳和淀粉胶电泳等低;提示： 巴比妥-巴比妥钠缓冲液pH？ 血清蛋白的等电点？ 所以结论是？ 向正极移动;1，2，4，5 γ-球蛋白；3．IgG；6．?-球蛋白；7．α2-球蛋白；8．α1-球蛋白；9．白蛋白;急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭：清蛋白降低，α1、α2，?-球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化：清蛋白降低，?、γ-球蛋白升高（γ-球蛋白升高2~3倍）； 急性炎症：α1、α2-球蛋白升高； 慢性炎症：清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎：清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高； 多发性骨髓瘤：清蛋白降低，γ-球蛋白升高，?和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。;二、聚丙烯酰胺凝胶电泳;聚合后的凝胶（gel）（凹槽形状较好）;聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 A、可在天然状态下分离生物大分子； B、可分析蛋白质和别的生物大分子的混合物； C、电泳分离后仍然保持生物活性（bioactivity）。;依据：不同蛋白质，分子大小（size of molecular 分子筛效应）、形状 、净电荷多少（net charge 电荷效应）等不同，电泳迁移率 分离效果好、分辨率高，可分出30多个清晰的成分 对比：纸电泳只能分出5~7个;人血浆蛋白质的等电点及分子量;凝胶浓度的选择 根据蛋白质的相对分子质量范围选择凝胶浓度 相对分子质量的范围10000~70000，用10％凝胶； 相对分子质量的范围25000~200000，可用5％凝胶； 相对分子质量更高，用3.33％凝胶 ;制备凝胶试剂的纯度 用高纯度试剂，影响凝胶聚合、电泳效果。 丙烯酰胺（Acr）、N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），关键试剂，分析纯或标准级的可立即使用。 Acr和Bis为神经毒剂，???皮肤有刺激作用，戴手套和口罩，纯化在通风橱内进行。 ;器材的清洗 硅橡胶条、玻璃板表面不洁净，电泳时凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时则凝胶板易断裂。 器材应严格清洗： 硅橡胶条、样品模槽板及电泳槽：洗洁精仔细清洗； 玻璃板：重铬酸钾洗液3~4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，清水洗净，海绵蘸取洗洁精反复清洗，蒸馏水冲洗，阴干、乙醇冲洗后阴干 ;器材的安装 位置要端正，均匀用力或旋紧螺丝，以免缓冲液渗漏。 样品槽模板梳齿应平整光滑。;凝胶的制备 不能有气泡，影响电流通过。 凝胶完全聚合后，必须放置30min 至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。;盐离子的影响（如硫酸铵） 防止区带拖尾，样品中盐离子强度（浓度）应尽量低，含盐量高的样品需脱盐（还记得用什么方法吗？）。;点样量 点样量大，样品不易分离 最大点样量不得超过100μg蛋白／100μL;预电泳 目的：去除凝胶杂质离子，使凝胶板达到所需的温度。 在不连续凝胶电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，浓缩胶制备后，不能进行预电泳。;电泳 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极 （positive and negative poles）不能接错，以免造成样品反方向泳动； 电泳时应用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果（什么样的影响？）。 ;配制过硫酸铵（AP）时应注意的问题 A、用近期生产的过硫酸铵，尽量取下层称量，以防过硫酸铵氧化失效； B、当放入水中时，要听到有轻微的拍拍声； C、临用前配制，盛于棕色瓶中，并存放在冰箱内，使用期不超过一星期。;总结：蛋白质类药物的电泳分析