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慢病毒生产及使用操作手册 一、试验步骤 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别搜集富含慢病毒颗粒细胞上清液，病毒上清液经过超离心浓缩病毒。以下内容由 HYPERLINK 汉恒生物科技（上海）精心整理总结。 二、试验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLVTM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株 293T，慢病毒包装细胞，为贴壁依靠型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞培养 （一） 293T细胞冻存 伴随传代次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了预防这类现象出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以确保试验稳定性和连续性。在细胞对数生长久进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留培养基； 2、加入0.25%胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，以后，将全部细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实际 n万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、依据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3 x 106个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保留，并作统计。保留过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T细胞传代 当细胞生长到汇合率达成80%～90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、依据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。 4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度培养箱中培养。 （三）293T细胞复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存细胞进行复苏。 1、设置温度为37～42℃水浴。 2、查看细胞库统计，依据统计从液氮罐中取出冻存细胞（需戴上棉手套，预防被冻伤），快速丢入水浴锅中并快速晃动，尽可能在1～2min内使细胞溶液完全溶解。 3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入5ml新鲜完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm培养皿。 5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后天天观察细胞生长情况。 四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增 构建好慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒大量去内毒素抽提。 （二）传293T细胞 将培养293T细胞T75瓶中培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇摆可发觉细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热10％ DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到靠近瓶口细胞。以后，将全部细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10％ DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。传代当日志为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-