实验八实验九大肠杆菌感受态细胞制备与转化.docxVIP

大肠杆菌感受态细胞制备与转化 为了提高转化效率 , 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度 : 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－ 70 ℃或 -20 ℃甘油保存 的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培 养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5×107 个 /ml 左右 ( 不同的菌株情况有所不同 ), 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度 : 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA) 。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比 ,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 , 转化效率就会降低。 1ng 的 cccDNA 即可使 50 μ l的感受态细胞达到饱和。 一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5％。 试剂的质量 : 所用的试剂 , 如 CaCl2 等均需是最高纯度的 (GR. 或 AR.), 并用超纯水配制 ,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行 , 所用器皿 , 如离心管 , tip 头等 最好是新的 ,并经高压灭菌处理 , 所有的试剂都要灭菌 ,且注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染 , 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入 , 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞 ,并用 CaCl2 处理 ,使其处于感受态 , 然后与 pBS 质粒共保温 ,实现 转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因 (Ampr ) ，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞 ,并用 CaCl2 处理 ,使其处于感受态 , 然后与 pBS 质粒共保温 ,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因 (Ampr ) ，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入 了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 同时做两个对照 : 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液 ,其它操作与上面相同。 此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液 ,但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数 ×稀释倍数 ×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每 mg 质粒 DNA）＝转化子总数／质粒 DNA 加入量 (mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数 ×稀释倍数 ×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 [ 注意 ] 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定 一样。有的转化效率高， 需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板 , 而有的转化效率低 , 涂板时必 须将菌液浓缩 ( 如离心 ), 才能较准确的计算转化率。 思考题 制备感受态细胞的原理是什么？ 2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ 二、大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性和局限性 1 1、优越性： 1）大肠杆菌是迄今为止研究得最详尽的原核生物 2）已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各种宿主菌和载体 3）培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行工业化批量生产 4）实验已经证明，许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达 2、局限性： 1）不具备真核生物的蛋白质复性系统 2）缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统 3）内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定 4）细胞膜间隙含有大量内毒素，可导致人体热原反应三、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法 1 、 CaCl2 法 1） CaCl2 法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的化学方法。 2）优点：