实验二 链霉亲和素－过氧化物酶法（20171024）.pptVIP

研究生学位课程 《免疫组化及相关组织学技术》 实验二 链霉亲和素-过氧化物酶法 (SP法) 叶 晓 霞 副教授 基础医学院 组胚教研室 一、实验目的和要求 实验目的 1. 掌握免疫组化染色的原理及步骤 2. 了解免疫组化实验的设计及问题解决方法 利用抗原（antigen, Ag），抗体（antibody）特异 结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。 免疫组织化学基本原理 二、SP法基本原理 （Streptavidin-Perosidase） 链霉亲和素-过氧化物酶连结法： 抗原 ＋ 一抗 ＋ 生物素标记的二抗 ＋ HRP标记的链霉亲和素(SP复合物) ＋ DAB，显色 棕色沉淀 HRP标记的 链霉亲和素 生物素偶联的 二抗 一抗 抗原 三、SP法优点 可检测酶、多肽、蛋白质、蛋白多糖、激素等多种物质。 与ABC、SABC法相比，SP复合物小，渗透能力强，反应速度快，灵敏 三步法，同一试剂盒（含二抗、SP、底物）可检测多种抗原 原位显示，可对检测物质初步定位 可半定量：淡黄－棕黄－深棕色，阳性细胞数。 四、SP染色法注意事项 载玻片的处理（多聚赖氨酸等粘附剂） 选择对照(阳性对照、阴性对照、空白对照、自身对照）消除假阳性、假阴性 染色过程不能干片 抗体和试剂的选择 一抗最佳浓度的确定：预实验，浓度梯度 抗原修复（酶/热修复等，根据试剂说明书） 显色时间的控制：2-5min，镜下观察控制 免疫组化结果的判断（部位，-，+，++，+++） 抗体和试剂的选择和处理 一抗特异性：物种（鼠抗人） 单克隆抗体 二抗特异性：先用二抗动物 来源正常血清封闭 （羊抗鼠二抗，羊血清封闭） “三抗”特异性：卵白素－生物素阻断组织中的内源性生物素，如肾、肝等。 DAB底物反应的特异性：H2O2处理，阻断组织中的内源性过氧化物酶。 A. DDX27——表达于细胞核； B、IP3R3——表达于胞浆 可检测物质在细胞中的分布情况。 SP法结果: A. p53在消化道腺癌中的表达 B. p53在正常癌旁组织中的表达 可检测物质在不同组织中的表达情况。 SP法结果: （一）染色前石蜡组织切片的准备 取材与固定（4%多聚甲醛） 脱水、透明与浸蜡 包埋 切片 烤干（暂时不用时低温干燥保存） 脱蜡复水 抗原修复（本次试验抗原不需要） 与HE 相同 SP法具体实验步骤 1. 脱蜡至水（同HE染色） 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 100％酒精Ⅰ 100％酒精Ⅱ 95％酒精Ⅰ 95％酒精Ⅱ 80％酒精 70％酒精 蒸馏水 10’ 10’ 10’ 10’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5′ （二）SP法染色流程1 10’ 10’ 10’ 10’ 5’ 5’ 5’ 5’ 2′ SP法具体实验步骤 7’ 7’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 1′ PBS 3%过氧化氢 PBS 山羊抗血清 一抗 PBS 二抗 PBS 三抗 3m*1 10′ 3m*2 10′ 室温20m 3m*2 10′ 3m*2 10′ （二）SP法染色流程2 勿洗 PBS 自来水冲洗 DAB显色 苏木精复染 脱水 返蓝 透明 3m*2 30s-1’ 1’ 1’ 8’ 10’ 5‘ 封片 画圈 SP法具体实验步骤 1. 苏木精复染1min,返蓝10min 2. 脱水，透明，封片 95％酒精Ⅰ、Ⅱ 各2 min 100％酒精Ⅰ、Ⅱ 各2 min 二甲苯Ⅰ、Ⅱ 各2 min 中性树胶封片 显微镜观察 (三）苏木精核复染及封片 SP法具体实验步骤 * * * * * *