pcr扩增的原理和步骤以及常见问题.docxVIP

10 10×扩增缓冲液 10 ul PCR 实 验 原 理 及 步 骤 PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过 程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由 变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成。 实验方法原理 ①模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 94℃左右一定时间后，使模 板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板 DNA与引物的退火 （复性） ：模板 DNA经加热变性成单链后， 温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸： DNA模板-- 引物结合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制 链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟， 2 ～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR反应体系 4 4 种 dNTP混合物 各 200 umol/L 引物各 10～ 100 pmol 引物 模板 DNA 模板 DNA 0.1 ～ 2 ug Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+1.5 mmol/L Mg2+ 加双或三蒸水至 100 ul 模板制备 （ 1）PCR的模板可以是 DNA，也可以是 RNA。 （2）模板的取材主要依据 PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病 毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细 胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 （3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。 多数样品需要经过 SDS和蛋白酶 K 处理。难以破碎的细菌，可用溶 菌酶加 EDTA处理。所得到的粗制 DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用 乙醇沉淀后用作 PCR反应模板。 PCR反应条件控制 PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 镁离子浓度总量应比 dNTPs的浓度高，常用 1.5 mmol/L 。 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制， 20～ 200 umol/L 。 TaqDNA聚合酶 2.5U（100 ul ）。 引物 浓度一般为 0.1 ～ 0.5 umol/L 。 反应温度 （1）变性温度和时间 95℃， 30 s 。 （ 2）退火温度和时间 低于引物 Tm值 5 ℃左右，一般在 45～ 55℃。 （3）延伸温度和时间 72℃，1 min/kb（10 kb 内）。 （ 4）Tm值 =4（G+C） +2（A+T） 循环次数 ：一般为 25 ～30 次。循环数决定 PCR扩增的产 量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循 环数并不是可以无限增加的。一般循环数为 30 个左右，循环数超过 30 个以后， DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数 的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。 PCR 技术具有高度的特异性、 选择性、灵敏性， 而且快速、 简便、 易于自动化，同时受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不 容易。在 PCR 技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至 会得到与事实完成相反的结果。 一、 假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物 电泳条带亮度均一， 这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现， 需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手： ⒈ 试剂污染： 厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受 到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于 PCR 仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而 有效地判断试剂是否已受到污染。 ⒉ 实验室污染： 这是最常见的污染源，由于 PCR 技术可以在几个小时内将模板中 某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过 程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实 验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程 度都较严重。 判断方法： 可以将实验中最关键步骤如试剂分装、 样 品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当 然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法： 实验室污染是 PCR 扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污 染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻 底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基 本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个 房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应 严格地分开，不可互换。 PCR