低剂量羧化黑碳和重金属铅共暴露诱发BEAS--2B毒性作用模式与机制研究.pdfVIP

阜阳师范大学硕士学位论文 摘 要 目的：本研究目的旨在探讨低剂量羧化黑碳 （Carboxylated black carbon）和醋 酸铅 （Lead acetate，Pb）对人体支气管上皮细胞 （BEAS-2B）的联合毒性作用。将支 气管上皮细胞单独或联合暴露于低剂量羧化BC （6.25μg/mL）和Pb （4μg/mL）中， 通过观察细胞的活力、产生的氧化应激、DNA损伤、线粒体膜电位的改变、细胞凋亡和 细胞炎症等联合毒性指标，研究其联合毒性。析因分析也可以用于确定羧化BC和Pb 之间的潜在相互作用。 方法：采用CCK-8试剂盒检测羧化黑碳和重金属铅共暴露24小时对BEAS细胞存 活率的影响；采用过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛试剂 盒检测细胞膜的完整性和细胞氧化应激；采用DCFH-DA探针检测羧化黑碳和铅联合染 毒后细胞的ROS水平；采用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA受损伤程度；采用JC-1 探针检测细胞内线粒体膜电位发生的变化，通过线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒检测； 通过流式细胞仪检测黑碳和铅材料诱发的细胞凋亡效应。 结果：羧化BC （6.25μg/mL）诱导的细胞活力与对照组相比无明显变化。同样， 4μg/mL剂量下，铅诱导的细胞毒性没有显著变化，因此，我们选择羧化BC（6.25μg/mL） 和铅 （4μg/mL）来研究它们的共暴露效应和相互作用。与对照组相比，单独暴露于羧 化BC或联合暴露于羧化BC和Pb 的BEAS-2B细胞的LDH水平显著升高，并且暴露于羧 化BC和Pb 的细胞的LDH水平最高。析因分析表明，LDH含量的增加是由羧化BC和Pb 的协同作用引起的。与单一处理组相比，羧化BC和Pb共暴露可显著增加MDA含量， 降低GSH-Px和SOD活性。这表明，与单一处理组相比，联合处理组能在更大程度上增 强氧化损伤。同样，在结合或羧化BC 中有更多的荧光阳性细胞。因此，羧化BC和Pb 的共暴露比单独羧化BC或Pb处理组能产生更多的细胞内ROS。细胞DNA损伤结果显示 与对照组相比，单独暴露于羧化BC或Pb 的BEAS-2B细胞对DNA损伤无明显影响。而 BEAS-2B细胞暴露于羧化BC和Pb 的联合作用下，可引起DNA损伤，表现为尾长、尾 第 I 页 摘 要 DNA含量、橄榄尾距和DNA损伤率显著增加。结果表明，羧化BC和Pb联合作用对BEAS-2B 细胞DNA损伤更为严重。为全面观察细胞凋亡，采用流式细胞仪检测暴露24小时后 BEAS-2B细胞中羧化BC和/或Pb处理组的凋亡情况。结果显示与对照组相比，单独暴 露于羧化BC或Pb处理组的BEAS-2B细胞凋亡率显著增加，而共暴露组的凋亡率显著 高于单独暴露组。为了揭示羧化BC与铅共暴露诱导细胞凋亡的可能机制，在羧化BC （6.25μg/mL）和/或Pb （4μg/mL）作用24小时后，检测线粒体膜通透性 （MMP）， 结果表明，与单一组分相比，羧化BC和Pb共暴露可引起线粒体去极化显著增加。为 了进一步探讨细胞凋亡相关蛋白所产生的变化，用caspase活性检测试剂盒检测 caspase-3、8、9的活性，发现单独暴露于羧化BC或Pb 的BEAS-2B细胞中，caspase-3 活性显著增强。此外，我们还评估了共暴露组氧化应激与凋亡标志物之间的相关性。 这些结果表明ROS的产生与caspase-3和caspase-9的凋亡标记密切相关。将BEAS-2B 细胞暴露于羧化BC和/或Pb环境中24小时，测定炎症细胞因子IL-6和TNF-α水平。 共暴露组的炎性细胞因子水平明显高于单纯羧化BC或Pb处理组，提示羧化BC与Pb 共暴露比单独暴露能促进炎症细胞因子的分泌。在IL-6的析因分析结果中观察到羧化 BC和铅共暴露的协同作用，而在TNF-α中发现了加性作用。 结论：本研究表明，低剂量羧化BC和Pb联合暴露可以引起人体支气管上皮细胞 氧化应激、DNA损伤、凋亡和炎症的增强。此外，析因分析进一步证明，协同作用和加 性相互作用是低剂量下羧化BC和Pb 的联合毒性的原因。我们的数据还表明，羧化BC 和Pb 的共同暴露可以引起一些意想不到的毒性，甚至超过已知的低剂量单一污染物的 毒性。本研究为大气污染物相互作用的研究提供了新的视角，为人类健康风险评价提 供了生