Orc6基因在小鼠植入前胚胎发育过程中的作用.pdfVIP

摘 要 6 Orc6 DNA 复制起始识别复合体 （ ）是与 复制起始有关的蛋白质，是复制起始识 ORC AAA+ATP DNA 别复合体 （ ）中唯一与 酶无关的亚基，对真核生物 复制起始发挥 着重要作用。目前除DNA 复制以外，Orc6还在异染色质形成、纺锤体组装等方面发 挥作用，然而到目前为止，其在早期胚胎发育过程中的作用尚不明确。本实验通过RNAi 技术研究Orc6基因的在早期胚胎发育过程中的作用，研究发现Orc6基因敲除的纯合 胚胎致死。然后通过RNAi 技术构建敲低模型，以获得充足的胚胎研究Orc6在小鼠植 入前早期胚胎发育过程中的作用。 1. Orc6-/-胚胎表型分析 E7.5 E3.5 E 7.5 通过取 和 的后代进行表型分析，我们发现 的胚胎基因型比例失调， 但 E3.5 胚胎的基因型比例符合孟德尔遗传定律，推测 Orc6-/-胚胎的死亡时间在 E3.5-E7.5之间，接着对E3.5胚胎进行Outgrowth 培养，纯合胚胎没有突破透明带。 2. Orc6mRNA 在植入前早期胚胎中的表达 利用定量PCR 技术对Orc6在卵母细胞以及早期胚胎的表达分析，发现Orc6 的表 达在胚胎发育的各个时期并无规律可循。从卵母细胞至受精卵阶段Orc6mRNA 的表达 2-cell 4-cell 8-cell 量显著增加， 期下降， 和 期表达量增加，桑葚胚期的表达逐渐下降， 到囊胚期表达量到达最低。 3. Orc6基因沉默对植入前早期胚胎发育的影响 胞浆注射Orc6siRNA 建立胚胎敲低模型，通过免疫荧光、定量PCR 等技术，了 解Orc6对小鼠胚胎发育第一、二次谱系分化的影响，以及Orc6基因缺失对细胞凋亡 Orc6 PrE 以及纺锤体组装的影响。实验结果发现 会通过影响 细胞命运决定的调节因子 Sox17 PrE Orc6 的表达，来影响 细胞命运分配。除此以外， 基因沉默会导致胚胎出现 无法修复的DNA 损伤，但Orc6基因沉默并不影响纺锤体组装。 Orc6 PrE DNA 综上， 基因沉默影响 细胞的命运分配，且导致不可修复的 损伤， 但对纺锤体的正确组装没有影响。通过实验，我们对Orc6基因功能有了进一步的了解， I 为胚胎发育第二谱系分化的研究提供了新的思路。 关键词：Orc6；胚胎发育；细胞命运决定；细胞凋亡；纺锤体组装 II 目 录 摘 要 Ⅰ ABSTRACTIII 目 录V 1 1 第 章 引 言 1小鼠早期胚胎发育过程1 1.1母体 合子基因组转变- 1 1.2 致密化与极化1 1.3胚胎发育第一次谱系分化2 1.3.1谱系分化经典模型2 1.3.1.1 TheInside–OutsideModel 2 内外模型 （