转录辅激活因子MED1在CCl4诱导肝纤维化中的作用研究.pdfVIP

摘 要 目的：肝纤维化是动态和高度整合细胞对慢性肝损伤的一种反应，是肝细胞炎症 引起的瘢痕组织过度堆积，最终会导致肝硬化甚至肝癌。MED1 是Mediator 复 合物的关键成员，其与转录因子相互作用促进转录起始复合物的形成，控制Pol II 的活性和延伸，参与对组蛋白密码、染色质高级结构及相分离的调控。尽管MED1 在肝脏再生和脂质代谢等方面发挥着作用，但其在肝纤维化中的作用及机制尚不 明确。 因此，我们通过GEO 数据库，对小鼠肝脏纤维化样本进行了筛查，运用 GEO2R 对样本进行质控、过滤及差异表达分析，并以肝脏MED1 特异性敲除小 鼠为模型，给予CCl4 刺激，构建肝纤维化损伤模型，通过HE 染色、免疫组化、 RT-PCR 和Western Blot 等技术手段探究MED1 在CCl4 诱导的肝纤维化中的作用 及分子机制。 方法： 一、利用GEO 数据库分析MED1 在肝纤维化中的表达 利用NCBI(/)GEO 数据库，以Liver Fibrosis 为 关键字对基因表达数据（鼠源）进行筛选，获得（GSE55747 ）健康和疾病状态 共计 10 个样本，利用GEO2R 对这 10 个样本进行质控、过滤及差异表达分析。 二、构建MED1 特异性敲除小鼠肝纤维化损伤模型 将MED1fl/fl 小鼠与MED1Δliv 小鼠杂交，获得子代小鼠，剪取3 周龄尾部提 取DNA ，PCR 检测Cre 阳性（有401bp 片段）表达。在第8 周龄开始持续 6 周 注射CCl ，每周3 次，构建肝纤维化损伤模型。 4 三、生化与病理学检测 Δ 利用 AST 、ALT 检测肝损伤 MED1 liv 和 MED1fl/fl 小鼠转氨酶水平，HE 染色观察肝细胞损伤及炎症状况，天狼星红和Masson 观察胶原沉积，免疫组化 检测肝星状细胞活化的分子标记（α-SMA）。 I 四、分子生物学检测 运用RT-PCR 和Western Blot 技术检测肝脏纤维化分子标记（IL-1β、TGF-β、 MMPs 、Colla1、TIMPs 等）mRNA 及FN-1、Egr1 、α-SMA 等蛋白表达水平。 结果： 一、GEO 数据显示，与健康样本相比，肝脏纤维化样本中MED1 及其家族成员 荧光值有显著的升高（p0.01 ），且GO 分析表明MED 家族在肝纤维化中参与 了细胞增殖调控。 二、PCR 结果鉴定表明，Cre 阳性（具有401bp 条带）的为MED1Δliv 小鼠。小鼠 腹腔最后一次注射CCl ，48 小时后称其体重，处死，MED1Δliv 相比MED1fl/fl 小 4 鼠肝脏颜色鲜艳质地柔软表面没有坚硬颗粒，且体重差异显著 （P0.01 ），说明 肝纤维化损伤模型构建成功。 三、MED1Δliv 较MED1fl/fl 小鼠ALT 与AST 水平显著降低（P0.01 ），说明MED1Δliv 小鼠肝损伤减少。MED1Δliv 小鼠HE 染色未形成中央静脉周围桥性病变，肝小叶 结构完整，肝细胞炎症浸润增加；天狼星红和Masson 结果显示MED1Δliv 小鼠胶 原沉积明显降低（P0.01 ），表明MED1Δliv 小鼠肝脏ECM 积累减少，免疫组化 进一步显示MED1Δliv 小鼠α-SMA 表达减少，说明肝星状细胞的活性被抑制，肝 纤维化减轻。 四、RT-PCR 结果显示MED1Δliv 小鼠MMP2 、MMP 13 mRNA 表达水平显著降低， TIMP1 表达减少，表明MED1 缺失影响基质金属蛋白酶的表达；MED1Δliv 小鼠 TNFα、MIP2 、Colla1 的表达减少，表明MED1Δliv 小鼠纤维形成减少。Western Blot 结果显示TGFβ1、α-SMA 和FN1 的表达降低，进一步证明MEDΔliv 小鼠肝纤维 化程度较轻。 结论： 在CCl4 诱导的肝纤维化模型中，肝脏MED1 特异性缺失能够抑制HSCs 的 激活，减少纤维的生成，从而可减轻肝纤维化程度。 关键词：肝脏MED1 特异性敲除小鼠；肝脏纤维化；肝星状细胞